A study on neuroprotective effects of methyl lucidone on glutamate-induced neuronal cell death in HT-22 neurons

Abstract

Oxidative stress elicits neuronal cell death in many neurodegenerative diseases, such as Parkinson's disease, Alzheimer's disease and ischemia. Therefore, it has been evaluated as the effective treatment strategy against neurodegenerative disorders to reduce neuronal cell death by decreasing intracellular reactive oxygen species (ROS). Methyl lucidone (MLC) was previously reported to suppress neuroinflammation in microglia. In the present study, the neuroprotective mechanism of MLC was investigated in HT-22 neuronal cells against glutamate-induced oxidative neurotoxicity. Pretreatment of MLC (0.1-5 µM) increased neuronal cell viability against glutamate-induced neuronal cell death. Glutamate-induced ROS production was decreased by MLC, although MLC did not show any free radical scavenging activity in cell-free condition, as shown in 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay. The expression of heme oxygenase 1 (HO-1) as an intracellular antioxidant enzyme was up-regulated by MLC treatment in HT-22 neurons. Nuclear translocation of NF-E2-related factor 2 (Nrf-2) known as a transcription factor of HO-1 was also up-regulated by MLC treatment. Furthermore, pretreatment of PD98059 as a pharmacological inhibitor of extracellular signal-regulated kinase (ERK) or SB203580 as p38 mitogen-activated protein kinase (p38) inhibitor did not affect the MLC-induced neuroprotection. To address whether phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway is involved in the upstream of Nrf-2, pretreatment of an inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), LY294002, suppressed the MLC-increased HO-1 induction and neuroprotection against glutamate-induced neuronal cell death. These results suggest that MLC significantly protects HT-22 neurons against glutamate-induced oxidative neurotoxicity by inducing the expression of the antioxidant enzyme HO-1 via PI3K signaling pathway.

산화적 스트레스는 신경세포 사멸을 유발시키는 주요한 원인 중의 하나로서 알쯔하이머 병, 파킨슨 병, 뇌졸중/허혈과 같은 신경 퇴행성 질환의 발병 및 진행과 관련이 있다고 알려져 있다. 그러므로 신경세포 내 활성산소가 급격하게 증가하는 병적 상태에서 이를 조절하여 신경세포의 사멸을 줄이는 것은 신경 퇴행성 질환에 있어서 매우 중요한 전략으로 평가되고 있다. 식물로부터 추출된 화합물이 여러 세포 종에서 세포 사멸에 대해 보호효과를 가진다는 연구가 많이 이루어 지고 있다. 비목나무 추출물에 포함된 화합물 중 하나인 methyl lucidone (MLC)이 미세신경아교세포(microglia)에서 신경염증을 억제하는 것이 이전에 보고되었다. 이번 연구에서는 신경세포에서 글루탐산염에 의해 유도된 산화적 스트레스에서 MLC의 신경보호 기전을 조사하였다. MLC (0.1~5 µM)를 처리하였을 때, 글루탐산염 신경독성 모델에서 글루탐산염에 의해 유도된 신경세포 사멸이 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다. 산화적 글루탐산염 독성 상황에서 세포 내 활성산소의 양이 증가되는 것이 이미 알려져 있다. 이러한 상황에서 MLC는 글루탐산염에 의해 증가된 활성산소의 양을 억제하였다. 세포 내 활성산소의 감소가 MLC의 자체적인 항산화 활성에 의한 것인지 알아본 결과, MLC는 항산화 작용이 없는 것으로 확인 되었다. 따라서, MLC에 의한 세포 내 활성산소 생성의 억제는 세포 내 항산화 효소의 발현에 관여하는 것으로 생각되었고, 그 중 하나인 heme oxygenase (HO-1)를 조사하여 보았다. MLC는 HO-1의 발현을 증가시켰고 그의 상위 신호분자인 NF-E2-related factor 2 (Nrf-2)가 핵으로 이동하는 것을 증가시켰다. 이러한 과정에서 Nrf-2의 상위 신호전달을 조절한다고 알려진 분자들 중 어떤 것이 관여하는 지 알아보았다. 각각의 억제제를 사용하여 실험한 결과, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 억제제는 MLC의 보호효과에 대해 아무런 변화를 보이지 않았지만 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 억제제는 MLC에 의해 유도된 HO-1의 발현과 보호효과를 감소시켰다. 이는 Nrf-2의 상위에 PI3K가 관여한다는 것을 의미한다. 결론적으로 MLC는 PI3K를 통해 Nrf-2의 핵으로 이동을 증가시키고 그에 따라 HO-1의 발현을 증가시킨다. 글루탐산염에 의해 증가된 세포 내 활성산소는 MLC에 의해 유도된 HO-1에 의해 억제되어 HT-22 신경세포에서 보호작용을 나타내는 것으로 확인되었다. 따라서 이번 연구는 MLC의 신경 퇴행성 질환에 대한 예방 및 치료제로의 활용 가능성에 대한 기초 자료를 제공하였다고 본다.