Protective effect of 7,8-dihydroxyflavone against oxidative stress in high glucose-damaged neuronal cells

Abstract

당뇨병성 신경증은 당뇨병 환자에서 흔한 만성 합병증 중의 하나로 신경세포의 손상 및 신경세포에 혈액을 공급하는 미세혈관 변성에 의한 말초 순환장애로 인해 유발되는 것으로 보고되고 있다. 이에 대한 원인으로는 고혈당증으로 알려져 있고 이러한 당뇨병성 신경증은 다양한 신호전달계의 활성에 의해서 발병하는 것으로 알려져 있다. 그 중 산화성 스트레스의 증가는 당뇨병에서 신경증을 포함한 여러 미세 혈관계의 합병증을 유발하는 데 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 연구에서는 당뇨병 환자의 혈청을 이용하여 산화적 스트레스의 정도를 지질과산화의 직접적인 지표인 8-isoprostane을 측정하여 유의하게 증가 되어있음을 확인하였다. 이러한 활성산소를 억제하기 위해 항산화제로 보고된 플라보노이드 계열인 7,8-dihydroxyflavone가 고농도의 포도당에 의해 유발된 SH-SY5Y 세포의 산화적 손상과 세포자연사에 대해 항산화 효과와 신경세포 보호 효과를 확인 하였다. 먼저 SH-SY5Y neuroblastoma cells에 산화적 스트레스를 유도하기 위해 고농도의 포도당을 처리하여 포도당이 증가할수록 세포의 생존율이 감소하였고 활성 산소가 증가하였으며, 7,8-DHF가 유의하게 차단 작용을 보여 주었다. 미토콘드리아에서 cytochrome c의 방출 및 미토콘드리아의 막 전위차를 조절한다고 알려져 있는 Bax, Bcl-2 단백질의 발현 양상은 고농도로 포도당을 처리한 군에서 pro-apoptotic protein인 Bax가 증가하였고, anti-apoptotic protein인 Bcl-2가 감소하였으며, 7,8-DHF를 처리한 군에서는 상반되는 반응을 보였다. 세포고사와 관련된 단백질의 발현을 알아보기 위해 고농도로 포도당을 처리한 군에서 caspase-9 protease와 caspase-3 protease활성이 증가 하였고 7,8-DHF처리한 군에서는 감소되는 현상을 보였다. 또한 세포고사가 미토콘드리아의 기능 변화와 관련되었는지의 여부를 알아보고자 미토콘드리아의 막 전위 차 변화(membrane potential transition;MPT)를 확인하기 위하여 JC-1 염색 후에 형광 현미경을 통해 관찰하여 고농도 포도당을 처리한 군에서 자연사가 일어난 세포질임을 보여주었다. 세포고사 기전에 의해 매개되었는지 여부와 이러한 세포고사에 ROS가 관여 하였는지 여부를 알아보고자, 세포고사의 형태학적인 특징과 관련된 단백질의 발현을 확 인하기 위해 세포의 핵을 Hoechst 33342 염색시, 고농도의 포도당군은 세포수가 적어지 고 핵이 여러 조각으로 분절된 형광염색을 나타내었고, 7,8DHF 처리한 군은 세포핵의 모양이 타원형의 균일한 형광염색을 나타내었다. 7,8-DHF은 이러한 경로를 통하여 산화 적 손상으로 유도된 세포자연사를 억제하는 것으로 확인하였다. 본 연구는 고농도의 포도당으로 유도되는 SH-SY5Y 신경세포의 산화적 스트레스에 대한 7, 8-dihydroxyflavone의 보호 효과를 확인할 수 있었다.

Oxidative stress is considered to be a major contributor in the pathogenesis of diabetic neuropathy and in diabetes complications such as nephropathy and cardiovascular diseases. Diabetic neuropathies, which are the most frequent complications of diabetes, affect sensory, motor, and autonomic nerves. Recently, 7,8-dihydroxyflavone (7,8-DHF) has been reported to act as a neuroprotective agent against glutamate- or 6-hydroxydopamin-induced toxicity via its antioxidant effects. However, the effects of 7,8-DHF against high glucose-induced toxicity in neuronal cells have not been reported. This study was designed to investigate whether 7,8-DHF may protect SH-SY5Y neuronal cells against high glucose-induced toxicity. 7,8-DHF restored cell viability, which was decreased by high glucose treatment, and scavenged reactive oxygen species (ROS) generated by the high glucose treatment. High glucose-induced apoptosis via ROS generation was assessed in terms of apoptotic body formation and mitochondrial membrane depolarization, and 7,8-DHF attenuated both the processes. Moreover, high glucose significantly modulated the expression of apoptosis-associated proteins. It reduced the expression levels of B cell lymphoma-2 (Bcl-2), increased the expression levels of Bcl-2-associated X protein, and induced the activation of caspase-9 and caspase-3. However, these effects were reversed by 7,8-DHF, which protected neuronal cells against high glucose-induced apoptosis. These results suggest that 7,8-DHF protects SH-SY5Y cells against high glucose-induced cytotoxicity through its antioxidant effects. Thus, 7,8-DHF may be developed into a promising candidate for the treatment of diabetic neuropathy.