Biological effects of Pyropia yezoensis and identification of their chemical structures

Abstract

김은 예로부터 식품 및 의약 재료로 사용되어지고 있으며, 항산화, 항염, 항고혈압 등과 같은 생리활성이 알려져 왔다. 하지만 이들에 대한 명확한 생리활성에 관한 연구가 진행되어진바가 없어, 이 연구에서는 김의 항염 및 항당뇨효능을 평가하고 유용성분을 규명하였다. 항염의 경우에는 세균 외독소인 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 RAW 264.7 세포내에 유발되어진 염증성 매개체인, nitric oxide (NO) 및 PGE2, TNF-α, IL-1β, IL-6와 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2에 대한 김의 효능 평가를 수행하였으며, 또한 NF-κB와 MAPKs pathway 검증을 통해 이들의 항염증 메커니즘을 규명하였다. 그리고 김의 간염 및 간섬유화에 대한 효능은 자극물질인 ethanol과 CCl4, 그리고 TAA를 통해 제작된 zebrafish 간염 및 간섬유화 모델을 적용하여 평가하였다. 또한 김의 항당뇨 평가를 위하여, α-glucosidase 저해 효능과 zebrafish 혈액내 glucose 함량 변화 등을 평가하였으며, 특히 마우스 유래 근육 세포인 C2C12내 glucose transfer인 Glut 4 transformation 유도 단백질인 AMPK와 AKT의 활성화 측정을 통하여 김의 항당뇨 효능을 평가하였다. 1. 방사무늬 김 유래 추출물에서 나온 각 n-Hexane, CHCl3, EtOAc, Water 분획물 중 n-Hexane 분획물이 가장 높은 항염증 효능을 보였으며, 이 분획물로부터 활성 성분을 분리하기 위하여 고속원심분배 크로마토그래피를 이용하였다. 분리된 compounds들 중 PYH5과 PYH6가 가장 우수한 NO 생성 저해 효능을 보였으며, 이들은, 각각 (11Z,13E,15E)-17-(5-hydroxycyclohexa-1,3-dienyl)heptadeca-11,13,15-trien-2-one와 1-ethyl-3-(3-(3-methylbutan-2-yl)-14-phenyltetradecyl)benzene으로 규명되어 졌다. 2. PYH5은 염증성 매개체인 PGE2, IL-1β, TNF-α를 농도의존적으로 감소시켰으며, 특히 NO와 PGE2를 방출시키는 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2에 대한 강력한 생성 저해 효능을 보였다. LPS에 대한 주요 염증성 매카니즘인 MAPK와 NF-κB pathways에 대한 평가 결과, MAPK 단백질인 ERK1/2, p38, JNK 중, ERK1/2를 강력하게 저해하였으며, 세포질내 활성화된 NF-κB의 생성을 저해 시켰다. PYH6 또한 염증성 매개체를 농도의존적으로 감소시켰으며, 염증성 단백질인 iNOS와 COX-2를 농도의존적으로 감소시켰다. 하지만, MAPK와 NF-κB pathway를 경로하지 않는 것으로 보아, 그외 AKT pathway등의 다른 경로를 통할 것으로 사료되어진다. 3. 김의 n-Hexane 분획물에서 분리된 화합물들중 PYH4가 가장 우수한 α-glucosidase 저해 효능을 보였을 뿐만 아니라, 마우스 근육세포인 C2C12 세포내 glucose uptake 효능이 가장 우수하였다. PYH4는 1H과 13C NMR 분석 결과 (E)-5-(8-hydroxynon-6-enyl)cyclohexa-2,4-dienol으로 규명되어졌다. 4. PYH4에 대한 in vitro와 in vivo 항당뇨 평가 결과, α-glucosidase의 저해 효능은 대조군인 Acarbose보다 우수한 74 μg/ml (IC50 value)의 높은 활성을 보였으며, molecular Docker를 통한 α-glucosidase active site에 대한 결합력을 조사한 결과, 강력한 결합 에너지를 보였다. 특히, zebrafish 혈액내 glucose 함량을 크게 줄이는 효능을 보였으며, GLUT4 transformation의 매개체인 AMPK와 AKT의 활성을 크게 증가시켰다. 결과적으로 세포막내 GLUT4를 활성화시켜 세포내로 glucose 흡입을 유도시켰다. 5. 염증성 질환중 하나인, 간염과 만성으로 인한 간섬유화에 대한 평가를 하기 위하여, ethanol과 CCl4 에 의한 zebrafish 간염 및 간섬유 모델 개발과 PYH5와 PYH6의 간보호 효능 및 항간염, 항간섬유화에 대한 평가 결과, 1% ethanol 처리군은 비처리군에 비해 매우 높은 간손상(GOP, GPT)을 보였으며, 특히 PYH5와 PYH6 처리군은 농도구배적으로 간손상을 낮추었다. 또한 1% ethanol을 매일 처리한 군은 염증성 매개체인 IL-1β와 IL-6, TNF-α, iNOS를 대폭 증가시켰으며, 반면 PYH5와 PYH6는 염증성 매개체들을 ethanol 처리군 대비 유의적으로 낮춰 주었다. 하지만, 1% ethanol의 4주간 처리에 의해 간섬유화 유도 염증성 매개체인 TGF-β1의 경우 유도되지 않았다. 기존에 잘 알려진 간염 및 간경화 유도 물질인 CCl4는 1주일에 2회 투여시 간손상 병변을 유도하였으며, 또한 염증성 매개체들을 대폭증가시켰다. 특히 CCl4의 경우에는 3주째 처리군에서 간섬유화 유도 염증 매개체인 TGF-β1이 강하게 발현되었다. 결론적으로, 방사무늬 김에는 염증성 질병에 관한 강력한 성분인 (11Z,13E,15E)-17-(5-hydroxycyclohexa-1,3-dienyl)heptadeca-11,13,15-trien-2-one와 1-ethyl-3-(3-(3-methylbutan-2-yl)-14-phenyltetradecyl)benzene 이 존재하였으며, 특히, zebrafish는 ethanol 및 CCl4에 의해 유도된 간염 및 간섬유화 모델로서 매우 적합하였다. 그리고, 우리는 방사무늬김 유래 컴파운드인 (E)-5-(8-hydroxynon-6-enyl)cyclohexa-2,4-dienol은 당뇨에 매우 강력한 물질임을 제안할 수 있다.