MOLECULAR PHYLOGENETICS, IMMUNOLOGY, AND REPRODUCTION OF SUBTROPICAL OYSTERS SACCOSTREA KEGAKI (TORIGOE & INABA 1981), OSTREA CIRCUMPICTA (PILSBRY 1904), AND HYOTISSA HYOTIS (LINNAEUS 1758) OFF THE SOURTHERN COAST OF JEJU ISLAND, KOREA

Abstract

제주 연안은 겨울철 수온이 13-18°C의 따뜻한 수온으로 인하여 다양한 저서생물들이 분포하고 있으며, 최근 들어 다양한 아열대 외래종이 유입되고 있다. 특히 과거 20년간 제주연안에서 다양한 아열대성 굴이 분포하고 있음이 확인되고 있으나 이들에 관한 연구는 미진한 실정이다. 이 연구는 제주 연안에 서식하고 있는 가시굴 (Saccostrea kegaki), 태생굴 (Ostrea circumpicta), 중국굴 (Hyotissa hyotis) 세 종을 대상으로 DNA marker를 이용하여 굴들의 유전 정보를 밝히고 분류학적 위치를 확인하였다. 또한 굴들의 면역 시스템을 이해하기 위하여 면역 세포의 특성을 규명하고 환경변화와 굴의 번식활동에 의한 면역 세포기능의 계절적 변화를 연구하였다. 1. Nuclear DNA 유전자를 이용한 제주도 연안에 서식하는 아열대성 굴 세종의 분자유전학적 분류 연구 굴의 분류학적 분석은 외형적 특징을 바탕으로 패각의 형태 및 색, 육질부의 해부학적 특징 연구가 주를 이루고 있으나, 외형적 특징은 환경적 인자에 매우 가변적이고 민감하여 분류학적 정보를 제공하는데 한계점이 있다. 이를 보완하기 위하여 분자생물학적 방법으로 핵에 존재하는 유전자의 염기서열 분석에 기초한 분자적 계통 분류 및 종 분류 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이 연구에서는 제주도 연안에 서식하는 아열대성 굴인 가시굴 (Saccostrea kegaki), 태생굴 (Ostrea circumpicta), 중국굴 (Hyotissa hyotis)의 분자생물학적 분류를 위하여 핵내 단백질 합성기관인 ribosome의 구성단위의 하나인 18S ribosomal RNAs (18S rRNA), rRNA 사이에 위치하여 전사가 일어나지만 기능을 갖지 않는 영역으로 종간 낮은상동성을 보이는 internal transcribed spacer (ITS) 및 진핵세포 내 염색체를 구성하는 chromatin의 구성원의 하나인 Histone 3 (H3)의 염기서열 분석을 하였다. 기존에 밝혀진 이매패류의 18S rDNA, ITS-1, H3 유전자들을 이용하여 multiple alignment를 수행하고 잘 보존된 영역의 서열을 비교 분석하여 nuclear gene을 증폭하기 위한 각 유전자에 대한 primer를 제작하였다. 굴의 패각근으로부터 total DNA를 추출 후 제작된 primer를 이용하여 PCR을 통해 유전자를 증폭, cloning 및 염기서열을 분석하였다. 결정된 염기서열은 neighbor-joining (NJ)와 maximum parsimony (MP) 방법을 이용하여 굴들의 계통학적 유연관계를 분석하였다. 세 종의 유전학적 분류 위치를 확인하기 위하여, 우리나라에 서식하는 참굴 (Crassostrea gigas), 강굴 (C. ariakensis), 바윗굴 (C. nippona), 벗굴 (O. denselamellosa) 및 미국의 대서양굴 (C. virginica)를 함께 비교 분석하였다. 세 가지 유전자는 동일하게 굴류를 Ostreidae 과 (Family)와 Gryphaeidae 과로 (Family)로 명확하게 구분이 되었다. 가시굴은 Saccostrea 속 (Genus), 태생굴은 Ostrea, 중국굴은 Hyotissa 속에 포함되었다. 가시굴과 태생굴은 유전적으로 유연관계가 가까우며, Crassostrea 종들과 sister branch를 형성하였다. 중국은 Ostreidae 과의 굴들과는 독립된 단일 계통군을 형성하고 있었다. 이번 연구 수행의 결과로 제주도 연안에 서식하는 아열대성 굴들에 대한 18S rDNA, ITS, H3의 유전정보를 새롭게 획득하였으며, 이는 굴류를 비롯한 해산 이매패류의 유연관계 분석에 유용한 정보로 이용될 것이다. 2. 제주도 연안에 분포하는 가시굴, 태생굴, 중국굴의 면역학적 비교연구 해산 이매패류의 혈구는 모든 조직세포 사이를 자유롭게 순환하며 내부 면역 외에도 영양분의 소화와 이동, 패각과 조직의 수선, 분비 등에 관여를 하며 생리적 안정상태를 유지한다. 또한 혈구 세포의 형태와 기능은 환경인자의 영향에 따라 다양하게 변화하기 때문에 해양환경 변화 모니터링 및 저서생물의 건강도 측정 등에 이용되고 있다. 이매패류의 혈구의 형태와 기능을 분석하는데 일반적으로 현미경이 사용되었으나, 이는 분석 속도가 느리고 혈구의 면역기능을 측정하고 정량적으로 분석하기에 한계가 있는 반면, 유세포 분석기 (flow cytometry)는 신속 정확한 방법으로 다양한 세포의 기능들을 정량적으로 측정할 수 있어 해산 이매패 혈구의 세포성 면역기작 측정에 매우 유용하다. 이 연구에서는 광학현미경과 유세포 분석기를 이용하여 가시굴 (Saccostrea kegaki), 태생굴 (Ostrea circumpicta), 중국굴 (Hyotissa hyotis) 세 종의 혈구세포의 집단을 분류하고, 이들의 면역 관련 기능들을 정량적으로 측정하여 비교 분석하였다. 번식활동이나 산란이 혈구 형태와 기능에 미치는 영향을 최소화하기 위하여 산란 후 성적으로 미분화기인 겨울철에 굴들을 채집하여 분석하였다. 굴의 패각근으로부터 혈림프액을 채혈 후, Hemacolor 염색 후 광학현미경 하에서 혈구의 형태를 관찰하였다. 혈구의 핵을 SYBR green I으로 염색 후 유세포분석기를 이용하여 혈구 세포만을 선택한 후 세포의 형태에 따라 집단을 분류하고 세포의 수를 측정하였다. Propidium iodide (PI)에 염색된 혈구 세포들의 비율을 측정하여 혈구 사망률을 측정하였다. LysoTracker Red를 이용하여 혈구 세포 내 lysosome 함량을 측정하였다. 마지막으로 형광 bead를 이용하여 혈구 세포의 식세포 능력 (phagocytosis)을 측정하였으며, 2'7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)를 이용하여 세포 내 비 유동성 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)와 활성질소 (reactive nitrogen speices, RNS) 생산력을 측정하였다. 가시굴, 태생굴, 중국굴의 혈구는 세포질 내 과립 (granule)이 많은 과립구(granulocyte), 과립이 없거나 적은 무과립구 (hyalinocyte or agranulocyte) 및 세포의 크기가 작으며 세포질이 얇은 blast-like cell의 세 가지 집단으로 동일하게 분류되었다. 혈림프 내 세포 집단 별 구성 비율은 세 종 모두 비슷하였으며, hyalinocytes가 59%로 가장 많으며 granulocyte가 23-31%, blast-like cell은 3-5%의 순으로 구성되었다. 광학현미경 관찰에서는 세포질 내 공포 (vacuole)들이 많은 vacuolated granulocyte도 관찰되었다. 유세포 분석기를 이용한 혈구 면역 기능 분석 결과, 세 종 모두 granulocytes가 세포질 내 lysosome 함량이 가장 많을 뿐만 아니라 세포성 면역 활동인 식세포 작용과 세포 산화 능력이 가장 활발한 것으로 확인되어 granulocyte가 주된 면역 세포임을 확인하였다. 식세포 능력은 가시굴이 가장 낮았으며, 세포 산화능력은 중국굴이 가장 낮았다. 세포성 면역활동 능력에 있어서 종간의 특이성이 확인되었으나, 이들의 면역 시스템 경로에 대한 보다 구체적인 연구가 요구된다. 이번 연구에서 가시굴, 태생굴, 중국굴의 혈구 집단 구조 파악 및 면역력 측정 결과는 제주 연안에 서식하는 아열대성 굴들의 병원성 생물 및 다양한 스트레스에 대한 면역 반응 연구에 중요한 기초 자료로 이용될 것이다. 3. 연중 환경변화와 번식활동이 굴 혈구세포에 미치는 영향: 조간대에 서식하는 가시굴과 조하대에 서식하는 중국굴의 비교 연구 해산 이매패의 혈구세포는 다양한 수온, 염분, 먹이 및 오염원 등의 외부적인 환경 변화뿐만 아니라 번식활동 등의 내부적인 변화에 따라 다양하게 변화하기 때문에 혈구의 구조적 특징과 기능들의 변화 조사는 대상 종의 생리학적 상태를 대표할 수 있는 좋은 마커 (marker)이다. 또한, 조석 차이에 의하여 일정 기간 공기 중에 노출되는 조간대와 항상 수층에 잠겨있는 조하대의 서로 다른 환경 조건에 의하여 서로 다른 생리적 변화를 나타낼 수 있을 것이다. 이 연구에서는 조간대에 서식하는 가시굴 (Saccostrea kegaki)와 조하대에 서식하는 중국굴 (Hyotissa hyotis)를 대상으로 혈구세포 수, 혈구 집단 별 구성비율의 변화, 혈구 사망률 및 식세포율의 연중 변화를 유세포 분석기를 이용하여 측정하였다. 채집 지역의 수온, 염분 및 먹이원인 chlorophyll-a의 함량의 정보를 채집하여 환경변화가 굴 혈구 세포에 미치는 영향을 알아보았다. 조직학적 방법을 이용하여 굴의 연중 번식주기를 규명하여 번식활동이 혈구 세포 기능에 미치는 영향을 조사하였다. 또한, 조간대와 조하대의서식환경에 따른 굴 혈구 세포 변화의 차이를 알아보았다. 조간대 굴의 혈구 수는 수온 변화와 양(+)의 상관관계를 보이며 연중 큰 변화를 보인 반면, 조하대 굴은 혈구 수와 수온변화와의 상관성이 관찰되지 않았다. 특히, 조하대 굴의 혈구 수는 기온과 수온이 높은 여름철에 급격하게 증가하는 모습을 보였다. 염분과 먹이량 (chlorophyll-a 농도)가 혈구세포의 미치는 영향은 관찰되지 않았다. 굴의 산란 및 산란 이후 혈구 사망률이 급격히 증가하였으며 식세포 능력이 상당히 저하되었다. 또한 이 시기에는 굴 체내 에너지원인 단백질과 탄수화물 함량이 매우 낮았다. 그러므로 에너지원을 많이 요구되는 산란활동에 의하여 면역 시스템에 충분한 에너지원이 공급되지 못함으로써 혈구 세포의 기능이 저하됨을 알 수 있었다. 면역학적, 조직학적 방법을 병합한 모니터링 한 이번 연구는 기존의 군집 차원의 연구에서 벗어나 개체군의 생리, 번식, 면역 등의 기능적인 특성을 분석한 결과로, 제주 연안에 서식하는 아열대성 굴들의 자원 관리 및 종 보존 차원뿐만 아니라 연안의 환경오염 및 수온 상승 등의 장기적 모니터링 연구에 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Previous studies have reported on the occurrence of subtropical oysters in shallow subtidal in Jeju Island where benthic animal diversity is recorded to be the highest in Korea. These subtropical oysters are believed to be extending their distribution range from southern Asia to Jeju due to the global seawater temperature increase. Despite its abundance and popularity, extremely few studies have been carried out on the ecology of these oysters in Jeju. Polymerase chain reaction (PCR) amplification, cloning and sequence determination of nuclear DNAs of Saccostrea kegaki, Ostrea circumpicta, and Hyotissa hyotis in Jeju Island were carried out to provide basic genetic information and phylogenetic relationship between species. The total genomic DNA was extracted from adductor muscles of each oyster species. For the analysis, 18S ribosomal DNA (18S rDNA), internal transcribed spacer (ITS), and histone H3 specific primers were designed based on conserved domains of each genes following the multiple alignments of published sequences of bivalves reported in the GenBank. The phylogenetic affiliation of the oyster species were analyzed by neighbor-joining (NJ) and maximum parsimony (MP) methods. The phylogenetic analysis allowed a clear distinction between Family Ostreidae and Family Gryphaeidae. Ostreidae oysters S. kegaki and O. circumpicta were group together and formed a sister group with genera Crassostrea. On the other hand, Gryphaeidae oyster H. hyotis formed a monophyletic clade as outgroup indicating a distant relationship between Ostreidae and Gryphaeidae. The results suggest that the nuclear DNA sequences including 18S rDNA, ITS, and H3 are useful tools in the identification of oyster species.To understand the immune system of subtropical oysters, as the second study, morphology and immune-related activities of the hemocytes in S. kegaki, O. circumpicta, and H. hyotis were characterized using light microscopy and flow cytometry. The hemocytes of the 3 oyster species could be classified into three types: 1) granulocytes, 2) hyalinocytes, and 3) blast-like cells. The percentage of each hemocyte population was similar in all species; hyalinocytes were the most abundant cell in the hemolymph accounting for more than 59%, followed by granulocytes (23-31%) and blast-like cells (3-5%). The size of granulocytes of S. kegaki was smaller (p < 0.05) than those of O. circumpicta and H. hyotis. Light miscopy also allowed the description of vacuolated cells characterized by large vacuoles in the cytoplasm. Flow cytometry analysis confirmed that the granulocytes of 3 oyster species was the major hemocytes engaged in the cellular defense as the largest lysosome content, the most active phagocytosis activity and oxidative activity, as was previously reported in several marine bivalves. Immune-related activity of hemocytes was different between the species. Phagocytic activity was the lowest in S. kegaki hemocytes and PMA-stimulated oxidative activity was the lowest in H. hyotis hemocytes. Our results provide the basic information of hemocytes population of three subtropical oysters for further investigations associated with various environmental stress of disease. Effects of seasonal changes in the environmental parameters on the hemocyte parameters and an annual reproductive cycle of the intertidal oyster S. kegaki and the subtidal oyster H. hyotis was investigated from March 2011 to February 2012. The hemocyte density strongly fluctuated with the surface seawater temperature in the intertidal oyster, while no clear seasonal pattern was observed in the subtidal oyster, possibly due to wide daily and seasonal temperature fluctuations and cyclic air exposure in the intertidal zone. Other environmental factors such as salinity and food availability had no direct influence on themeasured hemocyte parameters in both oysters. Immune-related hemocyte parameters (mortality and phagocytosis) of both intertidal and subtidal oysters were strongly correlated with an annual reproductive cycle of the oysters. The increase in hemocyte mortality and decrease in phagocytosis activity were observed when most of the oysters were in post-spawning condition. During post spawning period, levels of total protein and carbohydrate in the tissues were substantially lower than pre-spawning period, suggesting that oysters in post-spawning period may not hold enough energy reserves to be used in the maintenance of the cellular immune defense activity. The results of this study have provided the basic information of molecular phylogenetics, immunology, and reproduction for efficient resource management of subtropical oyster that inhabits in Jeju Island, and it can be used as efficient biomarker for monitoring environmental change.