양어사료 내 비타민 C 대체제로서 감귤착즙박 이용성에 관한 연구

Abstract

이번 연구를 통해 감귤착즙박(Citrus by-product, CBP)의 영양학적 우수성을 입증하여 경제적이고 기능적인 양어용 배합사료 원료로 제시하여 값비싼 합성 비타민 C의 부분 및 완전대체 효과를 조사하였다. 또한 CBP의 영양학적 우수성을 근거로 여러 유용균주를 이용하여 발효시킨 발효 감귤착즙박(fermented citrus by-product, F-CBP)의 제조와 그 기능성을 검증하여 양어용 배합사료 내 면역증강 첨가제로 사용 가능하도록 하는 기본 자료를 제시하였다.

1차 실험에서는 참돔 치어(초기평균무게 55g)를 대상으로 CBP와 Lactobacillus plantarum균주로 발효시킨 발효 CBP의 효능을 알아보기 위하여 대조사료에 CBP와 LP-CBP를 4%와 8%씩 첨가하여 총 5개의 실험사료를 설계하여 저수온환경(12℃-16℃)에서 9주간의 사료공급 실험을 진행하였다. 9주간의 성장실험이 끝난 후 성장률 및 사료효율은 모든 그룹에서 유의적인 차이가 없었다. Lysozyme, SOD 및 MPO활성에서는 CBP와 LP-CBP가 첨가된 그룹이 대조구에 비해 경향적 또는 유의적으로 높은 수치를 보였다. 이러한 이유는 CBP와 LP-CBP에 포함된 비타민 C와 여러 생리활성 물질에 의한 것으로 판단된다. 저수온 스트레스 11일째, 대조구가 급격한 폐사율(60%)을 보였지만 CBP와 LP-CBP가 첨가된 그룹은 25% 내외의 폐사율이 관찰되었다. 이상의 결과를 통해 경제적인 양어사료 제조를 위해 안정적인 비타민 C 공급과 폐기부산물의 재활용을 위해서라도 CBP를 사용한 친환경적인 사료를 개발하는 것이 우선적으로 요구된다.

2차 실험은 사료 내 CBP 첨가에 따른 합성 비타민 C의 대체율을 알아보기 위한 실험으로 사료 내 비타민 C 함량을 100 mg/kg으로 고정하고 합성 비타민 C(L-ascorbyl-2-polyphosphate, LAPP)와 CBP를 이용하여 대체율을 조절하였다(LAPP100/CBP0, LAPP75/CBP25, LAPP50/CBP50, LAPP25/CBP75, LAPP0/CBP100). 실험에 사용된 넙치 치어(초기평균무게 46.4g)는 제주도에 위치한 종묘배양장에서 구입하여 제주대학교 소속 해양과학연구소로 운송하였다. 사육수온은 실험기간 동안 11℃-15℃범위로 저수온 환경에서 6주간 실험을 진행하였다. CBP함량이 75%와 100%로 대체된 그룹이 LAPP100% 그룹에 비해 유의적으로 높은 성장률 및 사료효율을 보였다. 생존율은 모든 그룹에서 유의적인 차이는 없었다. 성장결과를 토대로 합성 비타민 C를 CBP로 완전 대체할 경우 저수온기의 넙치 성장에 전혀 문제가 없을 뿐만 아니라 오히려 저수온기 환경에 대한 스트레스를 감소시켜 성장률을 높일 것으로 판단된다. 면역분석과 조직학적 분석 결과에서는 모든 그룹에서 유의적인 차이가 없었다. 배합사료 내 값비싼 합성 비타민 C의 부분 혹은 완전 대체용으로 CBP가 사용될 것으로 가설을 세우고 증명함으로서 양식생산의 60%에 이르는 사료비용을 절감할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.

3차 실험에서는 조피볼락 치어(초기평균무게 4.5g)를 대상으로 비타민 C가 결핍된 대조사료에 LAPP와 CBP를 이용하여 90 mg/kg 및 360 mg/kg이 되도록 총 5가지의 실험사료를 제작(Con, LAPP90, LAPP360, CBP90, CBP360)하여 13주간 사료공급 실험을 진행하였다(사육수온 20℃-24℃). 최종무게의 경우 비타민 C가 결핍된 대조구가 유의적으로 가장 낮은 수치를 보였고 CBP360 그룹이 다른 그룹에 비해 유의적으로 높은 성장률을 보였다. 사료전환효율과 단백질이용효율에서도 성장률과 비슷하게 대조구가 가장 낮은 값을 보였다. 생존율은 대조구가 50%로 유의적으로 낮은 값을 보였고 LAPP나 CBP가 첨가된 모든 그룹은 73-90%의 생존율을 보였다. 대조구를 섭취한 그룹에서 비정상적인 안구현상(백내장)이 관찰되었지만, LAPP 또는 CBP가 첨가된 그룹에서는 첨가함량과 상관없이 결핍증상이 발견되지 않았다. 사료 내 비타민 C 함량이 증가(LAPP90, LAPP360)할수록 간에서의 비타민 C 함량도 증가되는 것을 확인할 수 있지만, CBP가 첨가된 그룹은 농도에 상관없이 일정한 함량을 보였다. 콜라겐 분석결과, 대조구에 비해 LAPP 또는 CBP가 적정농도일 때 유의적으로 높은 함량을 보였지만 고농도 그룹에서는 유의적인 차이가 없었다. Lysozyme과 total immunoglobulin활성에서는 LAPP 또는 CBP가 첨가된 모든 그룹이 대조구에 비해 유의적으로 높은 활성을 보였다. 성장실험이 끝난 후, Streptococcus iniae균을 이용하여 인위감염 시켰을 때(감염 18일째), LAPP와 CBP를 첨가한 그룹은 각각 75%, 91% (LAPP90, LAPP360)와 60%, 84% (CBP90, CBP360)의 생존율을 보인 반면, 대조구에서는 38%의 생존율을 보였다. 사료 내 적정함량 이상의 비타민 C 공급은 어류의 성장 및 면역반응을 증가시켰다. 따라서 CBP의 사용은 양어사료 내 여분의 비타민 C를 공급하여 잠재적인 성장 및 면역촉진제 역할을 담당할 것으로 판단되며, 양어용 배합사료 내 항생제 대체효과 또한 기대할 수 있을 것으로 판단된다.

4차 실험에서는 조피볼락 치어(초기평균무게 22.9g)를 대상으로 합성 비타민 C가 결핍된 대조사료에 LAPP, CBP 그리고 Bacillus subtilis와 B. pumilus 균주를 이용하여 발효시킨 CBP (BS-CBP, BP-CBP)를 이용하여 사료 내 비타민 C 함량이 100 mg/kg이 되도록 설정하였다. 사육수온은 18℃에서 25℃인 적정수온에서 13주간 사료공급 실험을 진행하였다. 최종무게의 경우 비타민 C가 결핍된 대조구가 유의적으로 가장 낮은 수치를 보였다. 사료전환효율과 단백질이용효율에서도 성장률과 비슷하게 대조구가 가장 낮은 값을 보였다. 생존율은 83-94%의 범위로 모든 그룹에서 유의적인 차이는 없었다. Lysozyme활성에서는 대조구가 유의적으로 낮은 활성을 보였다. Edwardsiella tarda균을 인위감염 시켰을 때(감염 25일째), 대조구에서는 4일째부터 폐사가 발견되었고 감염 25일째에는 약 40%의 낮은 생존율을 보였다. 반면, LAPP, CBP 및 발효CBP가 첨가된 그룹은 동일기간 동안 66-76%의 생존율을 보여 대조구에 비해 유의적으로 높은 생존율을 보였다. 양어용 배합사료에 LAPP나 CBP 및 발효CBP가 첨가된 그룹은 무첨가 그룹인 대조구에 비해 유의적으로 높은 면역활성과 질병저항성이 나타났지만, 두 종류의 생균제(B. subtilis 및 B. pumilus)로 발효된 CBP와 일반 CBP와 비교하였을 때에는 차이가 없었다. 따라서 우수성이 보고된 물질이라도 모든 어종에 동일하게 적용되는 것이 아니며, 생균제의 종류, 첨가방법 및 농도 그리고 발효조건에 따라 그 결과는 달라질 수 있을 것으로 사료된다.

이상의 연구결과를 종합해 볼 때, CBP의 양어사료 내 첨가제로써의 개발 가능성은 충분히 있을 것으로 판단된다. 특히, CBP는 양어사료 내 비타민 C의 대체제로써 손색이 없어 보이며, CBP에 다량 함유되어 있는 유용성분에 의해 어류의 비특이적 면역력 증강에도 좋은 효과가 있을 것으로 사료된다. 또한 CBP의 경제적 이용방법 활로를 개척할 수 있으며, 이는 감귤을 이용한 2차 생산제품 개발을 활성화하여 농, 어민 소득 증대뿐만 아니라 국내 양어용 배합사료의 질을 한층 높일 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 보다 구체적이고 지속 가능한 결론을 돌출하기 위해서는 타 어종에서의 장기간의 현장 실험과 EP배합사료 생산과정에서의 영양소 파괴 등에 관한 후속 연구들이 반드시 뒷받침 되어야 할 것으로 사료된다.

Chapter 1

Effects of dietary supplementation of a citrus by-product on growth performance, innate immunity and tolerance of low water temperature in red sea bream Pagrus major

Our aim was to determine the effects of a citrus by-product (CBP) and CBP fermented by Lactobacillus palntarum (LP-CBP), provided as dietary supplements, on the growth performance, feed utilization, innate immunity and temperature tolerance of red sea bream. A diet without inclusion of CBP or LP-CBP was used as a control and four other experimental diets were formulated to replace wheat flour by 4% and 8% of either CBP or LP-CBP (designated as Con, LP-CBP4%, LP-CBP8%, CBP4% and CBP8%, respectively). Experimental diets were fed to triplicate groups of 25 fish (initial body weight, 55.0 g) for 9 weeks. Growth performance and feed utilization were not significantly different among all the groups. Bone collagen content was significantly increased by supplemention with CBP and LP-CBP. Vitamin C concentration tended to be higher in livers of fish fed the supplements than in those of the control group. Myeloperoxidase, lysozyme and superoxide dismutase activities were higher in fish fed CBP or LP-CBP than in those fed the control diet. When fish were exposed to low water temperature, cumulative mortalities of those fed CBP or LP-CBP supplemented diets were lower (29%, 33%, 34% and 33% mortalities for LP-4%, LP-8%, CBP4% and CBP8%, respectively) than the control group (58%). Therefore, inclusion of either CBP or LP-CBP at up to 8% in red sea bream diet brings benefits through enhanced innate immunity and better tolerance of low water temperature.

Chapter 2

Evaluation of dietary citrus by-product as an L-ascorbyl-polyphosphate substitute for juvenile olive flounder (Paralichthys olivaceus)

This study investigated the effect of partial and/or whole replacement of dietary l-ascorbly-polyphosphate (LAPP) by citrus by-product (CBP) on growth performance of the juvenile olive flounder, Paralichthys olivaceus. Triplicate groups of juvenile olive flounder (initial weight of 46.4 g) were fed one of five experimental diets which were formulated to replace LAPP by CBP at 0%, 25%, 50%, 75% or 100% (designated as LAPP100/CBP0, LAPP75/CBP25, LAPP50/CBP50, LAPP75/CBP25 or LAPP0/CBP100). During 6 weeks of the feeding trial, feed intake and survival were not significantly different among all the fish groups. However, fish fed LAPP0/CBP100 group had significantly higher final body weight and feed conversion ratio than the LAPP100/CBP0 group. Immune response and histological parameters were not significantly different among all the groups. The results suggest that LAPP can be replaced in diet for the olive flounder by eco-friendly CBP to maintain their normal growth and health status.

Chapter 3

Replacing vitamin C source, L-ascorbyl-polyphosphate, with citrus by-product and digestibility in diets of Korean rockfish Sebastes schlegeli

The present study examined the effects of replacement of dietary vitamin C (VC) source (l-ascorbyl-polyphosphate, LAPP) by citrus by-product (CBP) on growth performance, feed utilization, innate immunity and disease resistance of juvenile Korean rockfish. A diet without LAPP and CBP was used as a control diet. Four other experimental diets containing two different levels of either LAPP or CBP equivalents of 90 and 360 mg/kg diet (designated as Con, LAPP90, LAPP360, CBP90 and CBP360 respectively). At the end of 13 week feeding trial, growth performance, feed utilization and survival rate of fish fed LAPP and/or CBP supplemented diets were significantly higher than fish fed the control diet. The VC concentration in the liver and bone collagen content were correlated positively with the dietary VC levels. Fish fed LAPP and/or CBP supplemented diets were significantly higher lysozyme and total immunoglobulin activities than those fed the control diet. In the challenge test against Streptococcus iniae, cumulative mortality of fish fed LAPP and/or CBP supplemented diets were significantly lower (8-40%) than the control group (61%). The findings in this study show that the CBP can be promising VC source for LAPP replacement in diet for Korean rockfish.

Chapter 4

Replacing vitamin C source with citrus by-product or fermented citrus by-product in diets of Korean rockfish Sebastes schlegeli

This study was conducted to investigate the dietary supplementation of citrus by-product (CBP) fermented with probiotic bacteria on growth performance, feed utilization, innate immune responses and disease resistance of juvenile Korean rockfish Sebastes schlegeli. Triplicate groups of juvenile Korean rockfish (initial weight of 22.9 g) were fed one of five experimental diets which were formulated to replace LAPP by CBP and/or fermented CBP with Bacillus subtilis and B. pumilus. A diet without LAPP and CBP was used as a control diet (Con, LAPP, CBP, BS-CBP or BP-CBP). At the end of 13 week feeding trial, growth performance, feed utilization and survival rate of fish fed control diet was significantly lower than fish fed the LAPP, CBP and/or fermented CBP supplemented diets. Fish fed control diet was significantly lower lysozyme activity than those fed the LAPP, CBP and/or fermented CBP supplemented diets. In the challenge test against Edwardsiella tarda, cumulative mortality of fish fed LAPP,CBP and/or fermented CBP supplemented diets were significantly lower (20-30%) than the control group (60%). The findings in this study show that the CBP and/or fermented CBP can be a promising VC source for LAPP replacement in diet for Korean rockfish.