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New Molecular and Pharmacological Mechanisms of Camptothecin in Cell Death and Cell Division

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Abstract
Camptothecin(CPT)은 항암 , 항균 효능을 갖는 단일화합물 로써, 중국과 티베트의 원 주민들이 정통적으로 널리 약초로 쓰이던 희수나무에서 유래하였다 . CPT는 1966년 처 음으로 보고 되었으며 , pentacyclic alkaloid적 성질을 가지고 있다 . 현재까지 CPT와 이의 유도체들은 전임상 단계까지의 단계까지의 연구가 성공적으로 성공적으로 진행되어있다 . 초기 세포를 대상으 로 한 CPT의 type I topoisomerase (topo) 활성 변화 연구는 의약품 개발 부분에 새로운 흥미를 이끌어 내었다 . 의약품로서 CPT는 췌장암과 난소암 치료에 사용되는 topotecan과 irinotecan의 반합성 물질로서 재개발되었다 . 거기에 더하여 기초연구에 있어서 CPT는 방사선치료와 병행하여 치료하는 것으로 연구가 진행되었다 .
이 학위논문에서는 CPT가 갖는 서로 다른 암세포주에서의 항암효과에 대한 in vitro 연구를 진행하였다 . 이 학위논문에는 CPT의 활성에 대해서 6가지의 다른 챕터로 나눠 항암효과에 대한 신호전달 과정을 진행하였다 . 첫 번째 단계는 , CPT가 전립선암 세포주인 LNCaP세포에서 cyclin B1, Cdk1, 및 다양한 단백질의 조절을 조절을 통해 G2/M arrest 유도한다는 내용이다 . 더 나아가 CPT에 의한 G2/M arrest 는 활성산소 활성산소 와 Cdc25c의 인산 화 활성의 변화로 인한 것임을 확인하였다 . 그리고 그리고 , 우리는 Nrf2가 ROS를 조절함으로 써 G2/M 세포의 비율을 조절하는 것을 찾아내었다 찾아내었다 . 이번 연구에서 Nrf2를 억제하자 산 화스트레스에 의하여 DNA가 손상을 입고 G2/M arrest가 유도 되는 것을 확실하게 보여 주었다 . 추가적으로 , 이러한 이러한 활성은 MAPK인 ERK와 JNK의 활성화와 활성화와 공동으로 일어나 는 것이 확인되었다 . 마지막으로 마지막으로 우리는 CPT가 autophagy의 활성을 통하여 G2/M arrest로 인한 apoptosis를 억제함으로써 세포 보호효과를 갖는 것을 보여주었다 .
두 번째 챕터에서는 LNCaP 세포를 이용하여 CPT의 세포주기 조절 과정을 분자세 포학적으로 이해할 수 있도록 연구를 진행하였다 진행하였다 . 우리는 CPT가 유도하는 G2/M phase arrest에서 Mad2의 역할을 역할을 조사하였다 . CPT가 JNK의존적인 Sp1의 활성을 통하여 Mad2의 발현증가를 확인하였으며 , mitotic arrest가 발생하는 과정에서 과정에서 Mad2에 의해 cyclin B1과 Cdk1의 발현이 발현이 증가함으로 Mad2의 결핍이 prometaphase arrest를 유도하는 것을 확인하였다 . 추가적으로 siRNA를 이용한 이용한 p21결핍은 CPT가 유도한 G2/M단계의 세포 비율은 감소하였지만 감소하였지만 , p21이 소모된 조건에서 조건에서 sub-G1의 증가는 유도하지 못하였 다. 하지만 , caspase-9억제제와 억제제와 autophagy억제제를 억제제를 전처리 한 조건에서는 조건에서는 조건에서는 apoptosis가 일 어나는 것을 방해하였다 방해하였다 . 이러한 결과들은 CPT가 항암제 개발에 있어서 있어서 희귀하게도 세 포주기와 microtubule 조절을 하는 좋은 잠재력을 가진 것이다 .
세 번째로 우리 연구의 목적은 서로 다른 암세포주에서 CPT가 autophagy를 통해 세포의 생존에 관여하는지 죽음에 관여하는지를 연구하는 것이다 . c-Myc의 결핍은 LNCaP 세포에서 PERK, eIF2α와 ATF의 인산화를 제거하였는데 , 이것은 이것은 c-Myc이 유도 한 UPR의 활성은 CPT에 의한 활성산소의존적임을 활성산소의존적임을 규명하였다 . 우리는 우리는 CPT가 LNCaP세포에서 c-Myc의 발현을 발현을 유도하는 것을 추가적으로 추가적으로 확인하였고 , 이것은 autophagy와 JNK의 활성을 통해 생성된 생성된 활성산소에 매개되는 UPR 시그널을 유도한다 유도한다 . 추가적으로 , 3MA를 통해 CPT가 유도한 유도한 autophagy를 억제하면 억제하면 , LNCaP의 세포죽음이 세포죽음이 증가한다 . 우 리의 연구결과는 AMPK의 인산화가 다른 조절인자들을 억제하는 것을 보여 준다 . 칼슘 의 세포질 내 축적은 APMK의 인산화와 autophagy를 유도하는데 필수적이다 필수적이다 . 그럼 으로 이 결과들은 CPT가 유도한 autophagy가 LNCaP세포에서 보호 작용을 하는 것을 증명한 다.
네 번째로 우리는 hTERT의 promoter가 포함된 luciferase 유전자 발현 실험 방법을 사용하여 CPT가 hTERT의 전사인자들을 조절하는 조절하는 기전에 대하여 규명하였다 . CPT는 농도 의존적으로 hTERT의 promoter 활성을 강하게 증가시켰다 . 또한 , CPT는 활성산소 의 생산을 유도하여 항산화 활성을 저해 하여 LNCaP세포 에서 활성산 활성산 소의 발현을 증가 시켰다 . TRAP-ELISA kit을 사용하여 CPT가 유도한 telomerase의 활성이 활성이 항산화제의 전 처리를 하자 감소하는 것을 확인하였다 . CPT의 처리는 LNCaP세포에서 c-Myc과 Sp1가 DNA와의 결합 활성을 증가시킴으로써 hTERT의 발현을 크게 증가 시켰다 . 이 결과들 은 CPT가 hTERT의 인산화를 증가시키고 Akt의 인산화를 통해 핵 안으로의 안으로의 이동을 방 해한다는 것으로 추정된다 .
다섯 번째로 , CPT가 MMP-9과 VEGF의 발현과 활성에 대한 연구를 연구를 진행하였다 . CPT는 PMA와 TNF-α에 의해 유도된 MMP-9의 mRNA와 단백질발현을 강하게 억제하 였다 . 추가적으로 , CPT는 유방암 세포주인 MDA-MB-231과 방광암 세포주인 T24세포 에서 PMA 자극에 의해 발현된 MMP-9의 mRNA발현을 강하게 감소 시켰는데 , 이것은 CPT가 서로 다른 암 세포주에서도 세포주에서도 MMP-9의 발현을 조절 할 수 있다는 것을 의미한다 . 더 나아가 , CPT의 전처리는 전처리는 유방암세포주인 MDA-MB-231과 방광암 세포주인 T24세 포에서 PMA와 TNF-α에 의해 유도된 VEGF의 mRNA 과발현을 강하게 억제하였다 . 우 리는 CPT가 DU145 세포에서 세포에서 NF-κB의 억제를 억제를 통하여 MMP-9과 VEGF의 발현 억제를 통하여 세포의 침윤작용을 방해하는 것을 추가적으로 확인하였다 . 이것은 CPT가 암세 포의 전이와 침윤을 억제할 수 있는 항암제로서 좋은 후보가 될 수 있음을 의미한다 . 이 번 연구에서 우리는 HO-1의 유도체인 CoPP가 PMA가 유도한 MMP-9과 VEGF의 발현 을 억제 하는 것을 확인 하였는데 , 이것은 CPT에 의해 발현된 HO-1가 MMP-9과 VEGF의 발현을 억제하는 것을 의미한다 . 우리는 CPT에 의해 활성화된 Nrf2 의존적으로 발 현된 HO-1이 PMA가 유도한 MMP-9과 VEGF의 발현을 억제한다는 것을 증명하였다 . 이것은 Nrf2를 억제한다면 HO-1에 의해 억제되는 MMP-9과 VEGF의 발현을 증가 시킬 수 있다는 것을 의미한다 .
마지막으로 , 우리는 CPT와 TRAIL의 병행 처리가 처리가 간암세포주인 Hep3B 세포에서 세포죽음을 유도하는 것을 연구하였다 . CPT와 TRAIL은 TRAIL에 저항성을 획득한 세 포에서도 세포의 증식을 억제하였다 . Caspase-8의 억제제인 z-IETD-fmk는 CPT와 TRAIL에 의해 강하게 증가된 sub-G1 phase, annexin-V 염색된 세포비율 , DNA 절편화를 강하게 억제하였고 , 이것은 이것은 CPT와 TRAIL의 병행 처리가 caspase 의존적인 apoptosis를 유도하는 것을 의미한다 의미한다 . 그리고 우리는 CPT와 TRAIL의 병행 처리에 의해 증가된 세 포 죽음이 DR5의 발현 증가에 의한 것임을 찾아 내었고 , DR5는 ROS와 MAPK인 ERK와 p38의 활성에 의한 것임을 증명하였다 .
Camptothecin (CPT) is a potent antitumor antibiotic isolated from extracts of Camptotheca acuminata, a tree native to China and Tibet which has been extensively used in traditional Chinese medicine. The structure was determined to be that of a pentacyclic alkaloid and was first reported in 1966. The success of CPT in preclinical studies led to clinical investigations. Due to the negligible water solubility of CPT, these trials were initiated using the water-soluble sodium salt. The discovery that the primary cellular target of CPT is type I DNA topoisomerase (topo) created renewed interest in the drug. Advances in the medicinal chemistry of CPT resulted in the semi-synthetic, more water-soluble analogues topotecan and irinotecan which are used clinically for the treatment of colon and ovarian cancers, respectively. Additional CPT analogues are under investigation, and are also of interest in combination regimens as radiation sensitizers. This dissertation is mainly focused on anti-cancer effect of CPT in different cancer cell lines in vitro studies. This dissertation is divided in to six chapters based on the different phases of signaling cascade in which the CPT activity is involved. In the first phase, we investigated that CPT-induced an irreversible G2/M phase cell cycle arrest in LNCaP cells which is associated with a marked decrease in the expression of G2/M regulating proteins such as cyclin B, cell division cycle 25C (Cdc25C) at Ser216. Further we reported that cell cycle arrest caused by the generation of reactive oxygen species and ataxia telangiectasia mutated check point kinase 2-mediated phosphorylation of Cdc25C. Our finding demonstrates that depletion of siNrf2 further induce the CPT induce S phase to G2/M phase cell population mean that Nrf2 regulate the G2/M arrest at S phase. Thus present study opens a clear view that inhibition of Nrf2 induces the oxidative stress lead to advanced DNA damage and prominent G2/M arrest. These events are coordinated with the activation of mitogen-activated protein kinases specially, extracellular-signal regulated kinase and c-jun-N-terminal kinase. Finally, we showed that CPT protects cells from apoptosis through autophagy, direct to the G2/M phase cell cycle arrest.
Second chapter illustrated that the molecular mechanisms underline the cell cycle regulation activities of CPT in LNCaP cells. We analyze the role of Mad2 in CPT induce M phase arrest. We report that CPT induces Mad2 expression through JNK dependent Sp1 activity. Also our data show the Mad2 knockdown produced clear suppression of prometaphase arrest, the important of Mad2 in up-regulation of cyclin B1 and Cdk1 protein levels and the development of mitotic arrest. In addition to that transient transfection of LNCaP cells with sip21 decreased the CPT-induced G2/M phase cell population but depletion of p21 didn't induce the sub G1 population. However, pretreatment of caspase 9 inhibitor and autophagy inhibitor increased the apoptosis cell percentage combine treatment with CPT. Importantly CPT has good potential as a novel class of cell cycle and microtubule pathway for cancer therapy.
Next phase our aim to investigate the effect of CPT on autophagy for the cell survival or death mechanism in different cancer cell lines. Depletion of c-Myc abrogated the level of phosphorylation eIF2α, PERK and also ATF4 in LNCaP cells suggest that cMyc-induced UPR activation is ROS dependent in CPT-treated LNCaP cells. We found that CPT induced c-Myc expression in LNCaP cells, which was induced UPR signaling mediated by ROS leading to activation of JNK cascade as well as autophagy. Further CPT-induced autophagy inhibited by the 3MA, a autophagy inhibitor increased the cell death in LNCaP cells. Our data also showed phosphorylation of AMPK downregulated with the presence of those regulators. Ca2+ accumulation in the cytosol was required for phosphorylation of AMPK and induction of autophagy. Therefore, these data confirmed that CPT-induced autophagy as cytoprotection mechanism in LNCaP cells. Fourth phase we revealed the underlying mechanisms involved in CPT-induced transcriptional control of hTERT using the luciferase gene expression system containing hTERT gene promoter region. CPT significantly increased the promoter activities of hTERT dose-dependent manner. CPT significantly induces the ROS formation in LNCaP cells whereas pretreatment of antioxidant abolished the CPT-induced ROS production. Using TRAP-ELISA kit, we found that CPT-induced telomerase activity was decreased in pre-treatment of antioxidant. CPT treatment resulted in a significant increase of c-Myc and Sp1 DNA binding activity in LNCaP cells and also CPT increases hTERT gene expression through enhance of c-Myc- and Sp1-binding on the regulatory regions of hTERT. These results suggest that CPT increases phosphorylation of hTERT and thereby possibly inhibit its translocation to the nucleus through the phosphorylation of Akt.
We, in the fifth phase, evaluated the effects of CPT on MMP-9 and VEGF expression and activity. CPT significantly downregulates PMA- and TNF-α-induced MMP-9 mRNA and protein expression. Additionally, CPT substantially downregulated the expression of PMA-stimulated MMP-9 mRNA in human breast carcinoma MDA-MB-231 cells and bladder carcinoma T24 cells, indicating that CPT suppresses MMP-9 expression in many different types of cancer cells. Moreover, pretreatment with CPT significantly inhibited PMA- and TNF-α-induced VEGF upregulation at the mRNA level in breast carcinoma MDA-MB-231 cells and bladder carcinoma T24 cells. We found that CPT reduces invasion of DU145 cells accompanying with downregulation of MMP-9 and VEGF via NF-κB inhibition, which indicates that CPT may be a good candidate to regulate cancer invasion. In this study, we found that CPT increases the expression of HO-1 and CoPP, an HO-1 inducer inhibits PMA-induced MMP9 and VEGF expression, while the suppressive effect of those gene expression due to CPT is significantly reversed by potent HO-1 inhibitor ZnPP, which indicates that CPT-induced HO-1 expression is intimately associated with the downregulation of PMA-induced MMP-9 and VEGF. We demonstrated that CPT leads induction of Nrf2 by a mechanism dependent on HO-1 expression assuming that CPT reverses PMA-induced MMP-9 and VEGF expression via Nrf2 dependent HO-1 expression. It is confirmed by silencing of Nrf2 increases the MMP9 and VEGF expression accompanying with induction of HO-1. Final chapter, we examined whether combined treatment with a sublethal dose of CPT and TRAIL (CPT/TRAIL) induces cell death in human hepatocarcinoma Hep3B cells. CPT/TRAIL effectively inhibits cell proliferation in TRAIL-resistant cells in a cell-type-nonspecific manner, although the combined treatment induces different antiproliferation rates. pretreatment with a caspase-8 inhibitor z-IETD-fmk significantly blocked apoptotic characteristics, such as DNA fragmentation, the presence of an annexin-V+ population, and the sub-G1 phase induced by CPT/TRAIL, indicating that CPT sensitizes Hep3B cells to TRAIL-induced apoptosis in a caspase-dependent manner. We found that CPT/TRAIL increases cell death via upregulation of DR5 expression through the generation of reactive oxygen species (ROS) and the activation of extracellular signal-regulated protein kinase (ERK) and of p38 mitogen-activated protein kinases (MAPKs).
Author(s)
RAJAPAKSHA GEDARA PRASAD THARANGA JAYASOORIYA
Issued Date
2015
Awarded Date
2016. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000007439
Alternative Author(s)
프라사드 자야수리야
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
김기영
Table Of Contents
Chapter 1 1
An introduction to anti-cancer mechanisms invitro . 1
1.1 Camptothecin as anticancer drug 2
1.2 Cell cycle and check point control as anticancer target 4
1.3 Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism 5
1.4 Regulation of the telomerase hTERT gene as a target for cellular oncogenic mechanisms 7
1.5 Anti-invasive mechanism of cancer cells . 9
1.6 TRAIL-induced apoptosis: a relevant tool for anticancer therapy . 10
1.7 Aims of this study . 13
Chapter 2 14
Camptothecin induces G2/M phase cell cycle arrest resulting from autophagy-mediated cytoprotection: Implication of reactive oxygen species . 14
Abstract 15
2.1 Introduction . 16
2.2 Materials and methods . 18
2.3 Results 22
2.3.1 CPT irreversibly induces G2/M phase arrest in various cancer cell lines 22
2.3.2 ROS are potential initiators of CPT-induced G2/M phase arrest . 24
2.3.3 CPT-induced Nrf2 in the early stage delays cell cycle at the S phase . 25
2.3.4 ATM-mediated Chk2 is a key checkpoint in CPT-induced G2/M phase arrest . 28
2.3.5 CPT-induced Cdc25C degradation requires the proteasome pathway in G2/M phase arrest . 31
2.3.6 ERK and JNK regulate Cdc25C-mediated cyclin B and p21 expression in CPT-induced G2/M phase arrest 35
2.3.7 CPT decreases cell viability, but not induces cell death 37
2.3.8 CPT-induced autophagy blocks cell death and leads to G2/M phase arrest 39
2.4 Discussion 42
2.5 Conclusion . 46
Chapter 3 47
Camptothecin induces mitotic arrest in LNCaP cells, resulting from Mad2-mediated cyclin B1 and Cdk1 expression: Implication of tubulin polymerization 47
Abstract 48
3.1 Introduction . 49
3.2 Materials and method . 51
3.3 Results 57
3.3.1 Mad2 is a key M phase check point in CPT-induced cell cycle arrest 57
3.3.2 CPT-induced Mad2 regulates cyclin B1 and Cdk1 . 60
3.3.3 CPT increases Mad2 expression by inducing JNK-mediated Sp1 activation . 62
3.3.4 CPT-induced phosphorylation of p21 promotes Mad2 expression . 64
3.3.5 CPT stimulates Mad2 expression resulting from tubulin polymerization . 66
3.3.6 Accumulation of procaspase-9 and autophagy regulates CPT-induced M phase arrest . 69
3.4 Discussion 72
3.5 Conclusion . 76
Chapter 4 78
Camptothecin enhances c-Myc-mediated endoplasmic reticulum stress, leading to autophagy 77
Abstract 78
4.1 Introduction . 79
4.2 Materials and methods . 82
4.3 Results 86
4.3.1 CPT induces c-Myc-mediated ROS generation, accompanied by CHOP expression 86
4.3.2 c-Myc regulates CPT-induced ER stress by inducing ROS generation 88
4.3.3 CPT promotes autophagy formation, resulting from ER stress . 91
4.3.4 CPT promotes autophagy by increasing intracellular Ca2+ release . 93
4.3.5 CPT induces JNK-dependent autophagy by enhancing AP-1 activity 96
4.4 Discussion 99
4.5 Conclusion . 101
Chapter 5 102
CPT induces c-Myc- and Sp1-mediated hTERT expression in LNCaP cells: involvement of reactive oxygen species and PI3K/Akt 102
Abstract 103
5.1 Introduction . 104
5.2 Materials and method . 107
5.3 Results 112
5.3.1 CPT increases hTERT expression and activity, which is not associated with G2/M phase arrest . 112
5.3.2 ROS regulate CPT-induced hTERT expression 115
5.3.3 CPT regulates c-Myc- and Sp1-dependent hTERT expression . 117
5.3.4 CPT induces PI3K/Akt signaling involved in hTERT expression 120
5.3.5 CPT induces apoptosis in human leukemia cells. 122
5.4 Discussion 124
5.5 Conclusion . 127
Chapter 6 128
Camptothecin suppresses matrix metalloproteinase-9 and vascular endothelial growth factor in DU145 cells through Nrf2-dependent HO-1 induction . 128
Abatract 129
6.1 Introduction . 130
6.2 Materials and methods . 132
6.3 Results 137
6.3.1 CPT has no influence on cell viability . 137
6.3.2 CPT suppresses MMP-9 expression and activity 139
6.3.3 CPT inhibits VEGF expression and production 141
6.3.4 CPTdownregulates NF-κB activity . 143
6.3.5 HO-1 induces CPT-induced MMP9 and VEGF inhibition . 145
6.3.6 Nrf2 regulates CPT-induced MMP-9 and VEGF expression by inducing HO-1 expression . 147
6.4 Discussion 150
6.5 Conclusion . 152
Chapter 7 153
Camptothecin sensitizes human hepatoma Hep3B cells to TRAIL-mediated apoptosis via ROS-dependent death receptor 5 upregulation with the involvement of MAPKs. 153
Abastract. 154
7.1 Introduction . 155
7.2 Materials and methods . 157
7.3 Results 160
7.3.1 CPT sensitizes various types of cancer cells to TRAIL-mediated cell death 160
7.3.2 CPT/TRAIL activates apoptotic signals via the extrinsic and intrinsic pathways 161
7.3.3 DR5 upregulation is required for CPT/TRAIL-induced apoptosis . 164
7.3.4 Reactive oxygen species (ROS) mediate CPT/TRAIL-induced upregulation of DR5 166
7.3.5 ERK and p38 potentiate CPT/TRAIL-mediated DR5 expression . 168
7.4 Discussion 170
7.5 Conclusion . 172
Bibliography 173
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
RAJAPAKSHA GEDARA PRASAD THARANGA JAYASOORIYA. (2015). New Molecular and Pharmacological Mechanisms of Camptothecin in Cell Death and Cell Division
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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