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Toxicity evaluation of marine algal arsenic in zebrafish model

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Abstract
제브라피쉬는 인간과 유전적 상동성과 허파를 제외하고는 간과 췌장, 지라와 흉
선 등 면역계를 포함한 대부분의 기관을 가지고 있는 척추동물로 최근 실험동물
모델로써 각광받고 있다. 이들은 체외수정을 하며, 수정란을 대량으로 쉽게 확보
할 수 있다. 그리고 난이 투명하여 배아의 발생과정, 혈류 흐름 및 형태적 관찰이
용이하며, 크기가 작아 공간의 제약을 받지 않는다. 또한 발생이 매우 빨라 대부
분의 조직 및 장기가 하루 만에 형성된다. 이러한 장점을 이용하여 최근 독성연
구에서도 동물모델로서 이용 되고 있다.
중금속은 인간의 건강을 위협하는 물질로 간주되면서 중요한 관리 대상이 되고
있다.
이중 비소는 극미량 원소 중 하나이며 다양한 형태의 화합물로 무기화합물 또는
유기화합물 형태나 비금속 상태로 지각과 생물, 환경 중에 널리 분포하는 금속
물질로서 강한 독성을 가지고 있는 주요 환경오염물질이다. 국제 암 연구기관 (In
ternational Agency for Research on Cancer)에서 비소는 인간에게 암을 일으키는
(carcinogenic) 물질, 혼합물, 노출환경 등인 'Group 1'로 평가될 만큼 유해성이 높다. 비소를 섭취하는 것은 신경학상, 심장혈관 상의 문제뿐만 아니라 피부암, 방
광암과 폐암의 원인이 될 수 있다 (ATSDR., 2007; Ming-Ho., 2005; EPA., 2011; I.
G. Jeoung., 2004). 비소의 독성과 관련된 논쟁은 전 세계적인 관심의 대상이고,
몇 백만 사람들이 비소 오염에 의해 영향을 받았다.
지구 표면의 71%를 차지하고 있는 해양에는 다양한 자원을 보유하고 있으며 저
온, 고온, 고압, 고염 등 다양한 극한환경을 내포하고 있다. 이러한 환경에 서식하
는 해양생물자원은 세계 동물성 단백질 공급량의 약 6분의 1을 차지할 정도로 식
량자원으로서 매우 중요한 부분을 차지하고 있다.
해조류(seaweed)는 전 세계적으로 바다에 서식하고 있는 수산물이다. 전 세계적
으로 약 6,000종, 식용으로는 150여종이, 한국에서만 약 500종이 발견되고, 식용
으로는 50여종이 이용되고 있다. 많은 종류의 해조류가 식품, 사료, 비료, 공업원
료, 의약품, 그리고 심지어는 오염물질 제거용으로 이용되고 있다.
그러나 급격히 산업화가 진행되고 경제가 빠르게 성장하면서 사람들의 관심은
웰빙을 비롯한 건강과 장수에 대하여 증가하고 있다. 더불어 환경오염, 스트레스
등에 따른 건강 위해 요인도 점점 증가하고 있어서 건강한 삶에 대한 사람들의
관심과 요구가 더 증가하고 더불어 건강식품에 대한 관심도 증가하고 있다. 이vii
에 따라 사람들에게 건강식품으로 그리고 산업에서 식품 및 의약품 원료로서 해
조류의 이용이 증가하고 있다.
해조류에는 육상식물에 비하여 많은 비소가 함유되어 있으며 높은 비소함량에도
불구하고 대부분이 독성이 거의 없다고 알려진 유기비소인 Arsenobetaine 형태
로 존재하기 때문에 안전하다고 한다(Abernathy CO., 2003). 그러나 해조류 중의
비소함량에 대한 기준 및 규격은 아직까지 정해지지 않고 있는 실정이다. 우선,
해조류에 존재하는 유기비소 화합물을 비롯한 총 6개의 유기비소화합물, 2개의
유기비소 화합물을 제브라피쉬 embryos에 0.25, 0.5, 그리고 1ppm의 농도로 처
리하였으며 생존율, 심박수, 부종크기 및 형태학적 관찰 등을 통해 유기비소 화합
물보다 무기비소 화합물의 독성이 센 것을 확인하였다. 성체에서도 이와 같은 실
험을 진행하였으며 5, 10, 그리고 20ppm 농도의 각 화합물에 노출된 간 조직을
조직학적 및Real-time PCR과 western blot을 통해 apoptosis pathway의 관련 인
자 및 단백질을 확인하였다. 그 결과, 모든 농도에서 유기비소 화합물보다 무기비
소화합물로 인한 독성으로 간 조직 병변 및 apoptosis 관련 인자 및 단백질의 발
현을 통해 유기비소 화합물 보다 무기비소 화합물로 인한 독성이 심한 것을 확인
하였다.
특히, 해조류에 포함된 유기비소 화합물(AsB)를 처리한 제브라피쉬에서는 유의
적인 차이가 없음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서는 영양가가 풍부하고 생리
활성작용 및 건강기능성을 가지고 있는 자연식품 및 기능성식품의 원료로서 이용
이 증가하고 있는 제주 연안에 서식하고 있는 감태, 미역, 그리고 톳으로부터의
비소를 추출하여 비소추출물에 대한 독성평가를 동물모델인 제브라피쉬를 통해
우리가 섭취하는 해조류의 안전성을 확인하였다. 해조류의 비소추출물을 embry
os에서 100, 500, 그리고 1000ppm의 농도로 처리하였으며 생존율, 심박수, 부종
크기 및 형태학적 관찰 등을 통해 1000ppm에서 처리하지 않은 그룹과 비교하여
유의적으로 차이가 있음을 확인하였다. 성체에서도 이와 같은 실험을 진행하였
으며200, 400, 그리고 800ppm의 농도로 처리하였으며800ppm에서 각 해조류의
추출물에 노출된 간 조직을 조직학적 및 Real-time PCR을 통해apoptosis pathwa
y의 관련 인자를 확인하였다. 그 결과, 각 해조류의 비소추출물에 노출된 성체는
모든 농도에서 다 생존하였으나 800ppm의 농도로 처리된 그룹의 간 조직 및 ap
optosis 관련 인자를 확인한 결과 처리하지 않은 그룹에 비해 유의적으로 차이가
있음을 확인하였다.
추출 후 해조류 비소의 건조중량에 비교하여 100ppm농도의 감태, 미역, 그리고 톳의 비소 추출물의 비소함량은 각 4.9, 3.5, 그리고 5.4 mg/kg 함량으로 계산
되었다. 비소함량이 최대인 톳 5.4 mg/kg을 기준으로 했을 때 연 평균 0.1 g의
톳을 섭취하는 한국인에게서 1일을 기준으로 섭취하였을 때 약 0.3 mg의 양으로
이는 1일 잠정섭취허용량의 약 228배임을 확인하였다.
이 모든 결과를 종합해 볼 때 OECD guide line에 따른 독성평가에서 유기비
소가 무기비소에 비해 독성이 없음을 확인하였으며 비소 1일 잠정섭취허용량은
2 g/kg이다. 60kg의 몸무게를 가진 성인의 비소 1일 잠정섭취허용량은 120 g/
kg으로, 연구에 사용된 시료 중 비소함량이 최대인 톳 100ppm (5.4mg/kg)을 기
준으로 했을 때, 22.2 g/day의 톳을 섭취한 양에 해당된다. 따라서, 한국인에게서
22.2 g/day 이상의 톳을 지속적으로 먹지 않는 이상 톳의 섭취에 따른 독성 가
능성은 미비하여 안전한 수준으로 판단되어진다.
Part Ⅰ.
One of the most toxic metals, As is widespread in the environment with a compound of
various types. Arsenic as significant risk substance has been ranked by Agency for Toxic
Substances and Disease Registry (ATSDR). Zebrafish (Danio rerio) has been developed into
an important model organism for biomdeical research over the last decades. Also, zebarafish
have advantages over mammals as an animal model for evaluating toxicity. Therefore, we
investigated the comparison between inorganic arsenic compounds and organic arsenic
compounds through survival rates, heart-beat rate, yolk sac edema size, cell death, ROS
production and morphology in zebrafish embryos. 4-hour post-fertilization (hpf) zebrafish
embryos were exposed to various concentrations of arsenic compounds (0.25, 0.5, and 1ppm)
until 96 hpf. Also, adult zebrafish was investigated in this study through survival rates,
morphology, real-time PCR and western blot. Adult zebrafish were exposed to various
concentrations of arsenic compounds (5, 10, and 20ppm) for 96 hours. Through the results,
zebrafish was strongly affected by exposure from inorganic arsenic compounds. Furthermore,
zebrafish can serve as a reliable model for the toxicity of arsenic compounds.

Part Ⅱ.
Seaweeds are known to compose a variety of bioactive substances (polysaccharides,
pigments, minerals, peptides, and polyphenols). However, it has been a significant concern
caused by arsenic content of seaweeds. Therefore, the present study was carried out to
evaluate toxicity of arsenic from Ecklonia cava, Undaria pinnatifida, and Hizikia fusiformis
in zebrafish model. Arsenic extracted from Ecklonia cava, Undaria pinnatifida, and Hizikia
fusiformis (ECAE, UPAE, and HFAE) by using 50% methanol in 1% HNO3 solvent. ECAE,
UPAE, and HFAE were added to each of the wells for up to 96 hpf. The survival rates of
embryos were no significantly changed at 100, 500, and 1000ppm. At 1000ppm, embryos
were significantly differences in morphology, heartbeat rate, yolk sac edema size, and
fluorescence. Also, we were assessed toxicity of algae arsenic in adult zebrafish at 200, 400
and 800ppm. The survival rates of adult zebrafish were no significantly changed at all the
concentrations. And, the bile duct of ECAE, UPAE and HFAE groups have no differences
compared with the control group. However, zebrafish were affected by exposure to HFAE in
the histopathology of liver. For these results, we were assessed the degress of toxicity of
arsenic from seaweeds in the zebrafish model.
Author(s)
양혜원
Issued Date
2015
Awarded Date
2016. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000007593
Alternative Author(s)
Yang, Hye-Won
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
INTRODUCTION 1
Part Ⅰ. Comparison of toxicity in zebrafish for organic and inorganic arsenic compounds 4
ABSTRACT . 5
MATRERIALS AND METHODS 6
Materials 6
Origin and maintenance of zebrafish . 8
Waterborne exposure of embryos to arsenic compounds . 8
Waterborne exposure of adult to arsenic compounds 8
Measurement of survival rate, heartbeat rate and yolk sac edema size in zebrafish embryos 9
Morphology observation in zebrafish embryos 9
Measurement of cell death by sample treatment and image analysis 9
Measurement of ROS production by sample treatment and image analysis 10
Histological evaluation in the liver of adult zebrafish . 10
Qunatitative real-time PCR 10
Western blot analysis of apoptosis pathway in zebrafish . 13
Statistical analysis 14
RESULTS . 15
Survival rates, heatbeat rates, and yolk sac edema sizes in zebrafish embryos/larvae after exposure arsenic compounds 15
Morphological changes in zebrafish embryos and larvae 20
Toxicity of arsenic compounds by AO staining in zebrafish larvae . 27
Toxicity of arsenic compounds by DCFH- DA statining in zebrafish larvae . 29
Gene expression . 31
Western blot 33
Survival rates in adult zebrafish after exposure arsenic compounds . 37
Morphological changes in adult zebrafish . 39
Histopathology in the liver of adult zebrafish 42
Gene expression in the liver of adult zebrafish 44
Western blot in the liver of adult zebrafish 46
DISCUSSION 50
Part Ⅱ. Toxicity assessment of arsenic from seaweeds in zebrafish model 53
ABSTRACT . 54
MATRERIALS AND METHODS 55
Materials 55
Extraction arsenic from seaweeds 57
Origin and maintenance of zebrafish . 57
Waterborne exposure of embryos to arsenic compounds . 57
Waterborne exposure of adult to arsenic compounds 57
Measurement of survival rate, heartbeat rate and yolk sac edema size in zebrafish embryos 57
Morphology observation in zebrafish embryos 58
Measurement of cell death by sample treatment and image analysis 58
Measurement of ROS production by sample treatment and image analysis 58
Histological evaluation in the liver of adult zebrafish . 59
Quantitative real-time PCR 59
Statistical analysis 59
RESULTS . 63
Survival rates, heatbeat rates, and yolk sac edema sizes in zebrafish embryos/larvae after exposure arsenic extracts 63
Morphological changes in zebrafish embryos and larvae 67
Toxicity of arsenic compounds by AO staining in zebrafish larvae . 74
Toxicity of arsenic compounds by DCFH- DA statining in zebrafish larvae . 76
Gene expression . 78
Survival rates in adult zebrafish after exposure arsenic compounds . 80
Morphological changes in adult zebrafish . 82
Histopathology in the liver of adult zebrafish 85
Gene expression . 87
DISCUSSION 89
CONCLUSION . 92
REFERENCES . 93
ACKNOWLEDGEMENT . 100
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
양혜원. (2015). Toxicity evaluation of marine algal arsenic in zebrafish model
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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