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Anti-cancer effect of saringosterol acetate isolated from Hizikia fusiforme in zebrafish model

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Abstract
제브라피쉬 (Zebrafish, Danio rerio)는 작은 열대성 담수어로써,
유전자정보 및 조직기관이 인간과 유사한 척추동물로 인간질환연구의
모델로써 높이 평가되고 있다. 특히 난이 작으며 투명하고 체외수정을
하여 해부현미경 하에서 쉽게 발생의 모든 과정을 관찰 할 수 있으며,
DNA, RNA을 배아에 직접 주입가능, 특정세포의 라벨화,
transplantation이 용이하여 RNA와 단백질 수준에서의 유전자 조절
연구를 손쉽게 할 수 있다. 초기 세포분열은 15분 간격으로 진행,
24시간이 지나면 심장의 박동과 혈액순환을 관찰 할 수 있을 정도로의
개체 발생 및 기관형성과정이 매우 빠르게 진행되고, 허파를 제외하고는
심장, 간, 췌장, 장등 면역계를 포함한 대부분의 조직기관을 가지고 있다.
또한 Zebrafish의 성체의 크기는 3~4 cm로 작아 사육공간의 제약이
없으며, 암컷은 일주일에 200~300개의 배아를 얻을 수 있다. 이러한
특징들로 인하여 생체 내에서의 세포생물학적 실험이나 대규모 유전학적
연구가 가능하기 때문에 질병연구, 신약개발 발굴의 모델로서의 이용이
용이하다.
질병 중 암은 사망원인별 순위에서 수십년동안 압도적으로 1위를 차지하고 있는 무서운 질병이다. 2014년 통계청에 주요암 사망분율을
살펴보면 사망률이 가장 높은 암종은 폐암(전체 암사망자의 22.8%), 간암
(15.1%), 위암 (11.6%), 대장암 (11.0%), 췌장암 6.7%), 담도암 (5.1%),
유방암 (3.0%), 백혈병 (2.2%), 전립선암 (2.2%), 비호지킨 림프종
(2.1%)의 순을 나타냈다. 암이 걸리는 원인은 아직 분명하게 밝혀지지는
않았으나, 국제암 연구소의 통계치에 의하면, 암 발생원인은 식습관
(30%), 흡연 (15~30%), 만성감염 (10~25%), 유전 (5%), 음주 (3%)로
암발생을 야기 시킨다고 발표하였다. 위의 결과에 따르면 암은 식습관에
밀접한 병이므로, 식습관을 조절하면 예방이 가능한 질병이다. 그리고
암을 치료하기 위해 여러 항암제를 사용하고 있으나 이들은 구토, 오열,
설사, 식용부진, 피부염, 발진, 탈모등 심한 부작용이 나타나 여러
문제점을 가지고 있어 여러 부작용이 나타나지 않는 항암제를 개발하는
것은 매우 중요하다.
최근 들어 현대인들의 건강에 대한 관심도가 증가함에 따라 웰빙,
힐링푸드 (Well-being, Healing Food)라 하여 질병을 예방하고 치료하는
음식에 대한 관심이 증가하고 있는 실정이다. 특히 해양생물자원 중
해조류는 식이가 가능하며, 이의 성분으로 다양한 구조와 생리활성도의
특이성을 가지고 있어 현대인의 식탁에서 매우 중요한 음식으로 자리매김 할 가능성이 매우 높다. 또한 해조류가 가지고 있는 다양한 성분으로
질병 예방 및 치료제 개발을 위한 강력한 신물질의 보고로 떠오르고 있다.
청정지역인 제주도는 사면이 바다로 둘러 쌓여 해조류의 보고로 알려져
있으며, 이를 이용한 항암 소재로서의 활용은 사회적 경제 산업적
측면에서 체계적으로 연구할 가치가 있다고 생각된다.
해조류 중 톳은 식이섬유, 칼슘, 철분등이 많이 함유되어있어
소화기능강화, 변비, 빈혈예방, 골다공증에 좋은 식품으로 바다의
불로초로 불리 우고 있다. 최근에는 항고지혈증, 항콜레스테롤, 항응고,
항비만 항당뇨, 항암, 탈모예방등의 톳의 기능성들에 대한 연구가
진행되고 있으며, 톳의 무한한 생리활성 대해서 기대 할 수 있다.
톳의 유용성분을 얻기 위해 시료의 손실을 최소화시키며, 재연성이
확실하고, 단시간의 분리가 가능한 고속원심분배크로마토그래피
(centrifugal partition chromatography, CPC)를 사용하였다.
CPC는 counter-current chromatography(CCC)의 한 분야의 기술로서
용매시스템을 이용하여 물질이 서로 섞이지 않게 2개의 층으로 분리한 뒤
한 층을 이동상으로, 다른 한 층을 고정상으로 하여 고체지지체 없이도
물질을 분리 정제 할 수 있는 시스템이다. 이러한 CPC를 이용하여 onestep과정으로도
순도 높은 물질을 분리해 낼 수 있어 항암물질을 분리해내기 위해 적합하여 CPC를 이용하여 물질을 분리하였다.
따라서 이 연구에서는 Zebrafish에서 암유발 물질과 암세포를 주입하여
암을 유도한 모델을 구축하고, 이 모델을 이용하여 해조류인 톳에서
분리한 saringosterol acetate(SSA)의 항암활성을 확인하였다.
톳은 70% Ethanol로 3시간 동안 3번에 걸쳐 초음파 추출을 하였다. 그 후,
최적의 n-hexane : ethylactetate : methanol : water = 5 : 5 : 7 : 1
의 비율로 CPC를 이용하여 8개의 fraction을 얻었으며, 그 중 3번
fraction의 ESI/MS와 NMR분석을 통하여 saringostrol acetate를
분리하였다, 이를 Human유래의 간암세포주 (Hep3B cell line),
전립선암세포주 (Du145 cell line)에서 항암활성을 확인하였다. 두개의
세포주에서 SSA는 농도의존적으로 세포를 사멸시켰으며, 샘플을 처리하지
않은 세포(Control)에서 보다 Sub-G1기를 농도의존적으로 늘려주어
세포의 apoptosis을 일으키는 것을 cell cycle을 통하여 확인하였다.
뿐만 아니라 세포성장, 세포생존조절 및 대사, 세포자멸사에 대한 방어에
중요한 역할을 하는 PI3K/Akt/mTOR 기전에서도 SSA는 농도의존적으로
인산화를 억제하는 것을 western blot을 통해 확인하였다.
종양세포가 기저막에 부착되면, 종양 세포에서 분비되는 단백 분해효소에
의해 기저막이 파괴되고 이 파괴된 기저막을 통해 종양 세포가 파급되어 주위의 결합조직으로 전파된다. 또한, 신생혈관생성(angiogenesis)은
종양의 발달, 증식, 전이에 필수적인 과정이다. 따라서 암의 국소침윤과
전이과정에 중요한 역할을 하는 것으로 기저막과 간질의 단백 분해에
중요한 역할을 하는 Matrix metalloproteinase (MMP)와 신생혈관의
생성을 촉진 시키는 Vascular endothelial growth factor (VEGF)
인자들로 종양의 성장과 전이에 대해서 확인을 하였다.
그리고 암에서 발현되는 일부 사이토카인 (Cytokines)은 암에 대한
단순한 숙주의 면역 반응 이외에 신생혈관 형성, 악성종양의 전이 등
생물학적 악성도와 관련이 있는 것으로 알려지면서 염증성 사이토카인
(Inflammatory cytokine)의 중요성이 대두되었다. 암에서 발현되는
대표적 염증성 사이토카인 중에서 다양한 암에서 세포사멸(apoptosis)을
억제하고 암의 성장을 촉진시키며, 암세포의 침윤 및 전이에 중요한
역할을 한다고 알려진 IL-6와 세포를 변형, 증식하며 암을 촉진시킨다고
보고된 TNF-α의 발현양을 확인하였다. 그리고 상피세포와 조혈세포의
성장, 이동, 분화 및 사멸등을 조절하는 다기능성 사이토카인인
Transformin growth factor-β (TGFβ)을 통하여 신생혈관 형성, 암세포
침윤 및 전이 등 암의 발생과 악성 진행에 대해서 real-time PCR과
Western blot을 통하여 알아보았다. H&E staining을 통하여 조직학적 변이에 대해서도 살펴보았다. 이로써 Zebrafish에 암이 유도 되었는지에
대해서 확인을 하였다.
그 결과 Zebrafish embryos에서 간암을 유도시키는 Diethylnitrosamin
(DEN) 물질을 농도별로 처리하였을 때 생존율은 감소하고, ROS (Reactive
oxygen specsis)가 증가, 세포사멸 (Cell death)가 증가하는 것을
확인하였다. 또한 Western blot을 통한 MMP2 and TGFβ, real-time PCR을
통한 MMP2, VEGFR2, TGFβ 가 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하여,
DEN이 Zebrafish embryos에 간암을 유도하는 것을 확인하였다. 그리고
DEN과 saringosterol acetate을 처리하였을 때에는 위의 지표인자들이
DEN을 처리 하였을 때에는 증가하였으나, saringosterol acetate을
처리하였을 때에는 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.
그리고 제브라피쉬 성체에 Human 유래의 Hep3B cell line, Du 145 cell
line을 각각 3일에 한번씩 30일 동안 2X106 cells 과 5X106 cells을
투여하였을 때 암이 전이 되는지에 대해서 살펴보았다. 그 결과 realtime
PCR을 통한 MMP2, VEGFR2, TGFβ, IL-6, TNF-α가 세포수가
증가할수록 발현 양이 증가하는 것을 확인하였으며, CM-Dil로 염색한
Hep3B, Du145 세포를 5X106 cells로 투여하였을 때, 간과 장과 배근육에
암세포들이 있는 것을 확하였다. 또한 Western blot을 통한 MMP2, pVEGFR2, TGFβ 발현, real-time PCR을 통한 MMP2, VEGFR2, TGFβ, IL-6,
TNF-α, H&E staining을 통한 조직학적 관찰과, 간암 표지자로 알려진
alpha-fetoprotin(AFP), 전립선암 표지자로 알려진 prostate-specific
antigen (PSA)을 확인하여 암이 유발됨을 확인하였다. 그리고
saringosterol acetate의 항암활성을 확인하기 위하여 암세포를 투여하기
1주일 전에 saringosterol acetate을 먼저 투여하고 3일에 한번씩 30일
동안 근육 주사하였으며, 암세포 또한 1주일 후 3일에 한번씩 30일 동안
투여하여 항암활성을 확인하였다. 그 결과 saringosterol acetate를
처리하였을 때 Western blot을 통한 MMP2, p-VEGFR2, TGFβ 발현, realtime
PCR을 통한 MMP2, VEGFR2, TGFβ, IL-6, TNF-α, H&E staining을
통한 조직학적 관찰과, 간암 표지자로 알려진 alpha-fetoprotin(AFP),
전립선암 표지자로 알려진 prostate-specific antigen (PSA)에서
농도의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 PI3K/Akt/mTOR
경로는 세포성장, 세포생존조절 및 대사, 세포자멸사에 대한 방어에
중요한 역할을 하므로 PI3K/Akt/mTOR 경로를 확인 한 결과 saringosterol
acetate가 농도의존적으로 암의 성장과 생존조절을 하는 것을 확인 할 수
있었다.
이 모든 결과를 종합해 볼 때, Zebrafish에서 화학물질 처리와 암세포 주입으로 암이 유도 되는 것을 확인하여 암 모델을 구축하였으며, 이
모델을 이용하여 톳에서 분리한 saringosterol acetate의 항암활성을
확인하였다. 그에 따라 saringosterol acetate는 항암 물질로서 잠재적인
기능성 식품 및 천연의학 소재로서 충분한 가능성이 있으며, Zebrafish
암 모델도 항암 연구에 있어 널리 이용 되어질 것이라 사료 되어진다.
Part Ⅰ.
Hizikia fusiforme, an edible brown alga, is widely consumed in Korea, Japan, and
China and possesses a number of potentially beneficial biological functionalities,
including anti-oxidants, anti-coagulant, anti-cancer, and anti-inflammation. Therefore,
the potent anti-cancer effects of saringostrol acetate (SSA) isolated from 70% EtOH
extraction of H. fusiforme was investigated for its inhibitory effects on liver and
prostate cancer in Hep3B and Du145 cell lines. The SSA markedly inhibited cancer
cell growth and increased the population of cells in sub-G1 compared to the control.
Furthermore, we confirmed that the mechanism involved in this process occurs
through PI3K/Akt/mTOR pathway an important regulator of cell growth, metabolism,
survival, metastasis, and resistance to chemotherapy. Therefore, SSA significantly
reduced the expression of PI3K, Akt, mTOR protein levels in both cells. These
results indicated that the SSA has the potential to be used in applications related with nutraceuticals or functional foods to reduce carcinogenic effects.
Part Ⅱ.
Diethylnitrosamin (DEN) is a well-known potent hepatocarcinogenic agent present in
tobacco smoke, water, cured and fried meals, cheddar cheese, agricultural chemicals,
cosmetics and pharmaceutical products. DEN is known to induce damage on many
enzymes involved in DNA repair and is normally used to induce liver cancer in
experimental animal models. Therefore, this study has confirmed an increase in the
production of reactive oxygen species (ROS) and induction of cell death by DEN
treatment. And angiogenesis is a necessary condition for invasion and metastasis
through angiogenic factors (VEGF, TFGβ1, MMP2). These factors are also increased
by DEN treatment in zebrafish. We observed that exposure to saringostrol acetate
(SSA), significantly inhibited DNE induced ROS, cell death and angiogenic factors.
These finding indicate that zebrafish model is an efficient animal model that can be
used to investigate DEN-stimulated cancer. Therefore, this model can be used as an in vivo experiment to confirm the anticancer properties of functional foods and
nutraceuticals
Part Ⅲ.
The zebrafish model system is one of the most widely used animal models. That is
attaining popularity as becomes an attractive model for molecular genetics,
developmental biology, drug discovery and screening of human disease. Especially,
the adult zebrafish has the potential to become an impact model for cancer-related
research. Metastasis is a key step of cancer progression that indicates a more
advanced stage and a poorer prognosis. Therefore, in this study, we established that
anti-metastatic and anti-invasive effects were occurred in cancer xenograft zebrafish
model. The zebrafish were injected with 20 μl of Hep3B or Du 145 cells (2X106 or
5X106 cells) in to their abdominal cavity once every three days for one month. After
one month, angiogenic factors (VEGF, TGFβ, MMP2, MMP9, IL6, and TNF-α)
were significantly increased in HepB and Du145-injected zebrafish models. And liver factor, α-fetoprotien (AFP), was higher than normal group. Also, prostate factor,
prostate-specific antigen (PSA), increased dose-dependently with cancer cell
concentrations. Therefore, a cell count of 5X106 was used in subsequent experiment
Then, we confirmed that saringosterol acetate (SSA) isolated from Hizikia fusiforme
have anti-metastatic and anti-invasive activities in cancer cell xenograft zebrafish
model. The zebrafish were injected with SSA (2 μg/g or 5 μg/g) once every three
days. After a week, the abdominal cavity of zebrafish were inoculated with 20 μl of
Hep3B or Du145 cells (5x106 cells) during ten times a month. All angiogenic factors,
AFP, PSA significantly reduced compared to cancer cell injected groups. We
observed a decreased expression of MMP2 and TGFβ pathways and phosphorylation
of PI3k/Akt/mTOR pathways in the liver tissues treated with SSA at 5 μg/g
concnetration. Therefore, this model can be used as an in vivo experiment to confirm
the anti-metastatic and anti-invasive effects of cancer.
Author(s)
김은아
Issued Date
2015
Awarded Date
2016. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000007594
Alternative Author(s)
Kim, Eun-A
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
INTRODUCTION. . 1
Part Ⅰ. Saringosterol acetate of Hizikia fusiforme exhibits an anti-cancer effect in Hep3B and Du145 cell lines 12
ABSTRACT 13
MATERIALS AND METHODS 15
Chemicals and reagents. 15
Preparation of crude extracts from Hizikia fusiforme. 15
CPC process 15
ESI/MS analysis of purified compound. 16
1H-NMR and 13C-NMR analysis of purified compound 16
Cell culture. 16
LDH Cytotoxicity assay 17
Cell cycle analysis 18
Western blot analysis 18
Statistical analysis. 19
RESULTS 20
DISCUSSIONS 29
CONCLUSION. 30
Part Ⅱ. Anti-liver cancer effect of saringosterol acetate in diethylnitrosamininduced zebrafish embryos 31
ABSTRACT. 32
MATERIALS AND METHODS 34
Chemicals and reagents 34
Origin and maintenance of parental zebrafish.. 34
Experimental design of diethylnitrosamin (DEN)-induced cancer.. 35
Determination of ROS production 36
Determination of Cell death. 36
Real-time PCR analysis 35
Western blot analysis 37
Statistical analysis. 38
RESULTS. 39
DISCUSSIONS 50
CONCLUSION 51
Part Ⅲ. The potential anti-metastatic and anti-invasive effects of saringosterol acetate of Hizikia fusiform in liver and prostate tumor xenograft zebrafish models 52
ABSTRACT. 53
MATERIALS AND METOHDS. 55
Chemicals and reagents 55
Cell culture 55
Fluorescent cell labeling. 55
Origin and maintenance of parental zebrafish.. 56
Experimental design of liver cancer cell xenograft 56
Determination of α-fetoprotein(AFP) production and prostate-specific antigen(PSA) production analysis. 57
Real-time PCR analysis 57
Western blot analysis 58
Histological analysis. 59
Embryo preparation and tumor cell implantation 59
Statistical analysis. 61
RESULTS. 59
DISCUSSIONS. 84
CONCLUSION. 87
REFERENCES 88
ACKNOWLEDGEMENT 95
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김은아. (2015). Anti-cancer effect of saringosterol acetate isolated from Hizikia fusiforme in zebrafish model
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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