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Role of melatonin on the regulation of reproductive system in the grass puffer, Takifugu niphobles

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Abstract
Chapter Ⅰ.
Fish have specific optimal spawning cycle depending on environmental factors such
as water temperature and photoperiodic conditions. The aim of the present study was
to investigate the reproductive cycle in the grass puffer, Takifugu niphobles, with
annual photoperiod and water temperature. Fish were sampled once a month from
February 2013 to January 2014, where we examined the monthly change in
gonadosomatic index (GSI) and hepatosomatic index (HSI). In addition, we examined
the phase of gonadal development based on histological observation. Day lengths of
sampling site was longest in June while shortest in December. Female and male HSI
levels increased from September to December. Female GSI levels showed a rapid
increase from April to June, and decreased in July. Male GSI levels also increased
from April and peaked in May, and then showed a rapid decrease until July. Based
on histological findings, ovaries showed frequent yolk stage oocytes (YO) from April
to June, meanwhile postovulatory follicles (POF) were identified in July. Spermatozoa
(SZ) were found in the testis from May to July, meanwhile in July and August, we
observed an empty cavity, reflecting an after-spermation testis. Based on the
histological microscopy of ovarian and testicular development phase, we divided the
reproductive cycle of the grass puffer into early growing, growing, maturing, and
resting phases.
According to our experiment results, the main spawning season of grass puffer is
suggested to be from June to July, and sexual maturation progressed with increased
day length and water temperature. Our results suggest that sexual maturation in grass
puffer was correlated with changes in the photoperiod and water temperature. Further
studies are needed to investigate the processes involved in these environment-based
effects on the reproductive mechanism.

Chapter Ⅱ.
Environmental changes stimulate the brain-pituitary-gonadal (BPG) axis, and may
activate the reproductive system. In this BPG axis, the GnRH is synthesized in the
hypothalamus, and consequently regulates the GtHs secretion from the pituitary.
Recent studies, kisspeptin and LPXRFa peptide identified in the hypothalamus.
Kisspeptin mainly plays a role in the production of GtH synthesis and release, but
LPXRFa plays a role in the inhibition of GtH synthesis.
The aim of the present study investigate the seasonal melatonin secretion and
reproductive-related genes expression during sexual maturation of the grass puffer,
Takifugu niphobles. For this purpose, we first examined the ocular melatonin
oscillation under natural photoperiod conditions. We observed that ocular melatonin
increased during scotophase. The concentration of seasonal ocular melatonin was
significantly higher in gonadal maturing phase compared with other gonadal
development phases. The scotophase expression of ocular aanat1 subtype genes and
brain aanat2 was increased mainly during maturing or resting phases. In addition, we
investigated the reproductive-related genes expression in the brain under different
gonadal development phases. In female, the expression of sbGnRH, chGnRH and
saGnRH mRNA were significantly higher in resting, growing and early-growing
phases; on the other hand, their expression in males were higher in maturing,
growing and early-growing phases. The kiss2 and lpxrfa mRNA expression in both
sexes was significantly higher in early-growing phase compared with other gonadal
development phases. In addition, seasonal igf-1 expression differed between sexes; in
females, it showed a peak during November, and in males, the peak was observed in
February. According to our results, seasonal variation of ocular melatonin suggested
effect upon sexual maturation in grass puffer. Brain reproductive-related factors
suggested that each gene acts independently, according to different gonadal
development phases. Further studies are needed to clarify the relationship between
melatonin and reproductive-related genes.

Chapter Ⅲ.
Recent studies in several fish species confirm the important role of melatonin in
regulating the seasonal reproductive cycle. The melatonin produced in the retina and
in the pineal organ is regulated by annual changes in the photoperiodic oscillation;
these changes in melatonin production consecutively regulate the reproductive
endocrine system. The aim of this study was to reveal the effect of melatonin in
reproductive endocrine system of the grass puffer. We investigated the aanat genes
oscillation under different photoperiod conditions. In addition, we conducted melatonin
injections to assess the associations between melatonin and reproduction-related genes.
Finally, we investigated the regulation of sexual maturation by means of treatments
with different artificial photoperiod conditions. In the investigation of the oscillation
of aanat genes under different photoperiodic conditions (short day photoperiod, SD
and long day photoperiod, LD), we observed nocturnal oscillation of aanat1a and
aanat2 mRNA in retina and brain under different photoperiodic conditions. Ocular
aanat1a showed different expression peak-times depending on different photoperiodic
conditions; brain aanat2 mRNA expression showed unchanged oscillation under each
SD and LD photoperiodic conditions. In the melatonin injection to assess the
associations between melatonin and reproduction-related genes, we observed a
significant induction of chGnRH mRNA in the brain. We also observed a significant
inhibition in the expression of kiss2 mRNA, and an increasing expression of lpxrfa
mRNA. Finally, in the regulation of sexual maturation by means of treatments with
different artificial photoperiod conditions for 14 weeks, we observed a significant
inhibition of GSI levels under SD group, compared with than in LD group. Based
on histological findings during the growing phase, the ovaries obtained from the SD
group presented initial ovary developmental phase, meanwhile the ovaries from the
LD group presented a maturing phase. The expression of kiss2 and lpxrfa mRNA
was inhibited in the SD group. These results are considered to be associated with the
melatonin-effect due to the SD treatment. The SD treatment was design to increase
the secretion of melatonin in retina and in the pineal organ; this melatonin would
have suppressed the reproductive-related factors.
어류는 광주기 및 수온의 변화에 적응하여 종 특이적인 산란시기를 갖는다. 어
류의 산란시기는 주된 생체리듬의 하나이며, 생체리듬은 다양한 생리현상을 조
절한다. 멜라토닌은 생체리듬을 조절하는 주요 조절자로서, 어류의 번식생리에
영향을 미친다. 어류의 멜라토닌은 송과체와 망막에서 분비된다. 이 연구는 복
섬의 번식특성과 멜라토닌의 역할에 대하여 조사하였다.
1. 복섬의 생식주기
복섬의 산란시기와 생식주기를 조사하기 위하여 월별 GSI 변화 및 생식소 발달
단계를 조사하였다. 암컷과 수컷 복섬의 GSI는 2월부터 4월까지 서서히 증가하
기 시작하였고 난소는 다수의 유구기 난모세포를 가지고 있고, 정소는 정모세포
와 정세포들을 가지고 있다. 이후 수컷과 암컷은 각각 5월과 6월에 가장 높은
GSI값을 보였고, 난소는 대부분 난황이 축적된 성숙한 난모세포들을 포란하였
다. 정소는 정자로 가득하였다. 이후 GSI는 8월까지 급격히 감소하였으며, 난소
에서는 산란 후의 잔존여포와 주변인기 난모세포들이 확인되고, 정소는 방정 후
비어있는 소엽 상태였다. 11월까지 암컷과 수컷 모두 낮은 GSI값을 유지하였으
며, 12월부터 GSI가 서서히 증가하기 시작하였다. 이 시기에 난소에 주변인기
난모세포와 유구기 난모세포가 분포하고, 정소에서는 정원세포와 정모세포가 관
찰되었다. 생식세포 발달 단계와 GSI 변화에 따른 복섬 암컷의 생식주기는 2
월~3월까지의 성장기, 3월~6월까지의 성숙기, 6월과 7월의 산란기, 7월~10월의
휴지기 그리고 이듬해 1월까지 초기성장시기로 구분되며, 수컷의 생식주기는 암
컷과 유사하게 나타났다. 이 결과 복섬의 산란시기는 6월과 7월로 추정된다. 광
주기와 수온변화에 따른 생식세포 발달은 광주기가 길어지고 수온이 증가하는
시기에 일어나고 있다.
2. 생식주기에 따른 멜라토닌분비와 성성숙인자들의 발현 변화
복섬의 생식주기에 따른 멜라토닌분비와 성성숙인자들의 발현 변화를 탐색하기
위하여 망막멜라토닌의 일주기 리듬과 계절별 분비 변화를 조사하였다. 그리고
복섬의 성성숙시기 동안의 멜라토닌 합성효소의 발현리듬변화와 성숙관련인자들
의 발현 변화를 조사하였다. 망막멜라토닌의 일주기 리듬 조사 결과, 멜라토닌
분비는 주로 야간에 증가하는 nocturnal 리듬을 보였다. 또한 망막 멜라토닌 분
비는 복섬의 성숙기에 가장 활발하였다. 망막 멜라토닌합성효소인 aanat1a mRNA
는 성숙기와 휴지기에 주야간 발현차이가 있으며, aanat1b mRNA는 성장기를 제
외한 성숙기, 휴지기 그리고 초기성장기에 낮과 밤의 발현차이기 있었다. 송과
체 멜라토닌 합성효소인 aanat2 mRNA는 오직 성숙기에만 낮과 밤의 발현차이가
있다. 성성숙인자들의 발현 변화를 보면, sbGnRH mRNA는 암수 각각 성숙기와 휴
지기에 유의적으로 높게 발현하였고, chGnRH mRNA는 성장기, saGnRH mRNA는 초
기성장기에 높게 발현하였다. Kiss2 mRNA와 lpxrfa mRNA는 암수 모두 초기성장
기에 발현이 높았다.
이러한 실험 결과 복섬의 망막멜라토닌은 nocturnal 리듬을 갖으며, 성숙기에
분비가 활발하게 이루어짐을 확인하였다. 성성숙인자들은 생식소발달단계에 따
라 특이적으로 발현하였으며, 초기성장기에 대부분 성숙관련 인자들이 높게 발
현하는 경향을 확인하였다.
3. 멜라토닌과 광주기가 성성숙에 미치는 영향
멜라토닌이 복섬의 성성숙에 대한 영향을 알아보기 위하여 일련의 실험을 수행
하였다. 첫 번째, 광주기 조건에서 단주기(9L:15D)와 장주기(15L:9D)가 멜라토
닌합성효소의 발현리듬에 미치는 영향을 조사하였다. 망막에서 aanat1a mRNA는
모든 광주기 조건하에서 nocturnal 리듬을 보였고, 광주기 길이에 따라 peak
time이 달랐다. aanat1b mRNA는 단주기 조건에서 특이적으로 주야간의 발현리
듬이 없었고, 장주기조건에서 주간에 발현이 야간 보다 높았다. 뇌에서의
aanat2 mRNA는 모든 광주기 조건에서 nocturnal 리듬을 보였으나, 그 리듬은 광
주기 길이와 상관없이 일정하였다. 이 결과를 통하여 망막에서의 멜라토닌합성
효소는 aanat1a mRNA가 aanat1b mRNA보다 빛에 대한 멜라토닌분비에 관여하며,
송과체에서의 aanat2 mRNA는 circadian 리듬에 따라서 멜라토닌 분비에 관여하
는 것으로 생각된다.
두 번째, 멜라토닌과 성성숙인자들의 상관관계를 조사하기 위하여, 멜라토닌(1
mg/kg)을 매일 정오에 2주 동안 복강주사하였다. 멜라토닌 처리한 실험구의 뇌
에서 chGnRH mRNA발현이 증가하였고, sbGnRH mRNA와 saGnRH mRNA는 발현차이가
없었다. Kiss2 mRNA는 발현이 억제되는 반면, lpxrfa mRNA는 발현이 증가하였
다. 뇌하수체에서 GtHs mRNA는 유의적인 차이가 없었다. 이 결과를 통하여 인위
적인 멜라토닌의 처리는 kiss2 mRNA의 발현 억제 및 lpxrfa mRNA의 발현을 증진
시켜 멜라토닌이 성성숙을 억제 하는 것으로 생각된다.
세 번째, 광주기가 성성숙에 미치는 영향을 조사하기 위하여 각각 단주기와 장
주기 조건에서 14주간 복섬을 사육하였다. 성성숙인자들의 발현 조사결과 오직
kiss2 mRNA와 lpxrfa mRNA가 장주기 조건에서 단주기 조건보다 발현이 유의적으
로 높았고, 다른 성성숙인자들의 유의적인 발현차이는 나타나지 않았다. GSI는
장주기 조건에서 유의적으로 높았으며, 생식소 발달단계는 단주기조건에서 유구
기 난모세포들이 분포하는 성장기였으나, 장주기 조건에서는 성숙한 난모세포들
이 분포하는 성숙기였다. 이를 통하여 광주기조절은 멜라토닌의 분비와 번식인
자들의 발현을 조절하고, 이를 통하여 성성숙을 제어하는 것으로 생각된다.
Author(s)
김병훈
Issued Date
2016
Awarded Date
2016. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000007674
Alternative Author(s)
Kim, Byeong Hoon
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
이영돈
Table Of Contents
국문요약 . ⅰ
List of figure ⅳ
List of table . ⅶ
Chapter Ⅰ. Reproductive cycle of grass puffer 1
Abstract . 2
1. Introduction 3
2. Materials and Methods . 5
2.1. Fish 5
2.2. Hepatosomatic index (HSI) and gonadosomatic index (GSI) of grass puffer 7
2.3. Histological observation 7
2.4. Statistical analysis 7
3. Results 8
3.1. Monthly changes of HSI and GSI 8
3.2. Gonadal development phase . 11
3.3. Reproductive cycle of grass puffer . 14
4. Discussion 16
Chapter Ⅱ. Seasonal melatonin variations and reproduction-related genes expression in grass puffer 19
Abstract . 20
1. Introduction 21
2. Materials and Methods . 24
2.1. Experiment design . 24
2.1.1. Daily oscillation of ocular melatonin . 24
2.1.2. Ocular melatonin and aanats genes variations during sexual maturation 24
2.1.3. Seasonal variations of reproduction-related genes and igf-1 expression 25
2.2. IGF-1 cDNA partial cloning and sequence analysis . 25
2.3. Tissue specific expression of aanats genes 28
2.4. Total RNA extraction and cDNA synthesis . 28
2.5. Real time-qPCR . 28
2.6. Ocular melatonin measurement 31
2.7. Statistical analysis 31
3. Results . 32
3.1. IGF-1 cDNA partial cloning and phylogenetic analysis . 32
3.2. Distribution of igf-1, aanat1a, aanat1b and aanat2 genes 35
3.3. Daily oscillation of ocular melatonin 38
3.4. Variations of ocular melatonin secretion during sexual maturation 40
3.5. Variations of aanat genes expression during sexual maturation . 42
3.6. Seasonal expression of reproduction-genes in the brain during sexual maturation . 47
3.7. Expression variations of igf-1 mRNA during sexual maturation in the liver 50
4. Discussion 52
Chapter Ⅲ. Effect of melatonin on sexual maturation in grass puffer 58
Abstract . 59
1. Introduction 61
2. Materials and Methods . 63
2.1. Effect of artificial photoperiod regulation in aanats genes expression in retina and brain . 63
2.2. Effect of melatonin in reproduction-related genes expression . 63
2.3. Control of sexual maturation by artificial photoperiod regulation . 64
2.4. Real time-qPCR . 65
2.5. Statistical analysis 67
3. Results 68
3.1. Change of aanat1a, aanat1b and aanat2 mRNA oscillation in each retina and brain under different photoperiodic conditions . 68
3.2. Relations between melatonin with reproduction-related genes expression 73
3.3 Regulation of sex maturation in grass puffer by artificial photoperiodic control . 76
4. Discussion 82
References . 88
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
김병훈. (2016). Role of melatonin on the regulation of reproductive system in the grass puffer, Takifugu niphobles
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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