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Isolation of BEMB from Polysiphonia japonica inhibit LPS-induced pro-inflammatory by preventing ROS production and down-regulating NF-kB in in vitro and in vivo Zebrafish models

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Abstract
The anti-inflammatory effects of 3-bromo-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenediol (BEMB) from
Polysiphonia japonica were evaluated in lipopolysaccharide LPS induced in RAW264.7
macrophages and Zebrafish models. BEMB had anti-inflammatory effects, inhibiting nitric
oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS),
cyclooxygenase-2 (COX-2), interleukin (IL)-1β, and interleukin (IL)-6 productions in LPSactivated
RAW264.7 cells, without inducing cytotoxicity. Furthermore, BEMB inhibited
LPS-induced NF-κB activation and reactive oxygen species (ROS) production in RAW 264.7
cells. Moreover, in this study investigated the effect of anti-inflammatory through NO and
ROS production in zebrafish embryos. BEMB significantly inhibited LPS-induced NO and
ROS generation similar to the ROS inhibitors, N-acetylcysteine (NAC). BEMB and NAC
also suppressed the expressions of iNOS and COX-2 in LPS-stimulated zebrafish embryos.
Moreover, BEMB suppressed mRNA expression of NF-kB (p65, p100/52 and ikbA) in LPSinduced
zebrafish. Collectively, in this study data indicate that BEMB suppresses the
production of pro-inflammatory mediators such as iNOS and COX-2 as well as their
regulatory in LPS-induced RAW264.7 cells and zebrafish embryos by inhibiting the ROS and
NF-kB. Therefore, this study suggest that BEMB should be utilized as potential antiinflammatory
agents for the treatment of inflammatory diseases.
염증은 생체 또는 조직에 물리적 자극, 화학적 물질, 세균감염 등의 변화를
가져오는 자극이 가해질 때 손상부위를 복구하려는 생체반응으로서 자극이
가해지면 국소적으로 염증성 성분이 증가되면서 염증이 유발이 된다. 하지만,
염증반응이 만성화되면 류마티스 관절염, 동맥 경화증, 위염, 천식, 당뇨병 및
심혈관 질환 등의 각종 질병의 원인이 되며, 염증성 질환이 유발된다 염증반응에
관여하는 대표적인 세포 중 하나인 대식세포는 염증성 매개물질인 interleukin
(IL)-6, IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α) lipopolysaccharide (LPS)와
같은 자극에 의해 염증반응의 전사인자인 nuclear factor-κB (NF-κB)를
활성화시키며 pro-inflammatory cytokine과 nitric oxide (NO), prostaglandin
E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2)
등의 염증유발인자들을 생성한다.
이러한 염증 치료제로 천연자원을 이용한 연구들이 많이 하고 있으며, 자원들 중
하나로 해조류에 대한 관심이 많아 지고 있다. 해조류는 칼륨, 요오드, 칼슘 등의
각종 무기염류와 비타민 A,C 등의 함량이 높은 자원이며, laminaran 및 fucoidan
등과 같이 인체에 유용한 다당류뿐만 아니 라 여러 생리활성물질을 함유하고
있다. 해조류의 다양 한 생리활성에 대한 연구들이 증가되고 있으나, 홍조류의
떨기나무꼴폴리시포니아 (Polysiphonia japonica) 에 대한 연구는 미비한 편이다.
특히 떨기나무꼴폴리시포니아 추출물에서 분리한 물질들에 대한 항염증 실험,
세포실험 및 동물실험에 대한 연구는 보고되어 있지 않다. 그래서 이 연구에서는
떨기나무꼴폴리시포니카에서 분리한 3-bromo-5-(ethoxymethyl)-1,2-
benzenediol (BEMB)에 항염효과를 세포실험, 대표적인 대식세포인 RAW264.7
세포를 이용하여 수행하였다.
먼저, 떨기나무꼴폴리시포니카를 80% 메탄올 추출을 하고 그 후 클로포름 분획
물에서 3-bromo-5-(ethoxymethyl)-1,2-benzenediol (BEMB)를 분리하였다.
그리고 BEMB를 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 독성과 NO, PGE2
생성양을 확인하였다. 그 결과, BEMB 12.5, 25, 50 μM에서 독성이 없었으며,
농도 의존적으로 NO와 PGE2양이 감소함을 확인하였다. 그 후, western blot
분석방법을 통해 염증유발인자 인 iNOS, COX-2 단백질 발현양을 확인한 결과,
가장 높은 농도인 50μM 에서 iNOS, COX-2 단백질 발현양이 매우 감소함을
확인 할 수 있었으며, ELISA kit를 이용하여 cytokine (IL-6, IL-1β)의 양 또한
농도의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 그리고 다시, western blot
분석방법을 통해 염증반응 전사인자인 NF-κB의 활성화를 확인하였다. 그결과,
인산화된 P65, P105가 BEMB의 50 μM에서 발현양이 줄어듬을 확인하였다.
세포 내의 활성산소종 (Reactive oxygen species ROS) 생성 역시 염증 반응에서
중요한 인자이다. ROS의 조절로 염증이 억제되는지 확인 하고자 LPS로 자극된
RAW264.7 세포에 BEMB 와 대표적인 ROS 억제제인 N-acetylcysteine
(NAC)을 처리 하여 ROS의 발생양을 확인하였다. 그 결과, BEMB가 처리 된
부분에서는 ROS의 양이 억제되었으며, 억제된 양은 NAC이 처리된 군과
비슷하였다. NAC이 처리된 비교군 또한 LPS가 처리된 군 보다 ROS, NO양이
줄어들었으며, western blot 분석방법을 통해 iNOS, COX-2의 발현양 또한
줄어듬을 확인하였다.
제브라피시는 인간과 유전적 상동성과 간,췌장,흉선등 면역계를 포함한 대부분의
기관을 가지고 있는 척추동물로 최근 실험동물 모델로 주목받고 있다.
체외수정을 하며 난을 대량 확보 가능하고, 난의 투명하여 형태적 관찰이
용이한다. 이러한 장점을 이용하여 최근 염증연구에서도 동물모델로서 많이
이용되어 지고 있다. BEMB가 RAW264.7 대식세포 상에서 항염증효과를 보여
동물실험으로 항염증 효과를 확인하기 위해 LPS로 자극된 제브라 피쉬에서
염증효과를 확인하였다.
그 결과 LPS가 자극된 제브라피쉬에서 BEMB가 농도 의존적으로 NO, ROS 생성
양과 iNOS, COX-2 단백질 발현양이 억제됨을 확인하였다. 또한 LPS가 자극된
제브라피쉬에서도 NAC을 처리한 결과, NO, ROS 생성양과 iNOS, COX-2 단백질
발현양이 억제됨을 확인하였다.
또한, 제브라피쉬에서 RNA를 추출하여 PCR 결과 BMEM 50μM에서 NF-κB의
관련 유전자의 발현이 줄어듬을 확인 하였다.
이 모든 결과를 종합해 볼 때, 떨기나무꼴폴리시포니카에서 분리한 BEMB는
RAW264.7 세포에서 ROS 발생양과 NF-kB 활성화를 조절하여 항염증 효과를
나타내었으며, 더 나아가 동물모델인 제브라피쉬에서도 ROS 발생양과 NF-kB
유전자를 조절하여 항염증 효과를 나타내었다. 이로써 떨기나오꼴폴리시포니카는
천연 염증치료제로 사용할 수 있음을 사료되어진다.
Author(s)
고은이
Issued Date
2016
Awarded Date
2016. 8
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000007822
Alternative Author(s)
Ko, Eun-Yi
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
국문초록 . iii
LIST OF FIGURES vi
ABSTRACT 1
INTRODUCTION 2
MATRERIALS AND METHODS . 5
Materials . 5
Isolation of BEMB from Polysiphonia japonica 6
Cell culture 8
Determination of NO production and cell viability 8
Determination of PGE2 and cytokine production . 8
Western blot analysis in RAW264.7 macrophages . 9
Measurement of ROS of intracellular reactive oxygen species in RAW264.7 cells . 10
Detection of NF-kB in RAW264.7 cells by immunofluorescence and confocal Microscopy 10
Maintenance of zebrafish 11
Measurement of ROS and NO production in Zebrafish by image analysis 11
Western blot analysis in zebrafish 12
RNA extraction and quantitative RT-PCR (qRT-PCR) 12
Statistical analysis . 13
RESULTS AND DISCUSSIONGS . 15
Extraction and isolation of BEMB from Polysiphonia japonica 15
Effect of BEMB form P.japonica on production of NO and PGE2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells 19
Effects of BEMB on iNOS and COX-2 protein in RAW264.7 cells . 21
BEMB inhibit LPS induced cytokine production . 23
Effect of BEMB on LPS-induced NF-kB activity in RAW264.7 cells . 25
Effect of BEMB on LPS-induced ROS generation in RAW264.7 cells . 28
Effect of BEMB against LPS-induced NO production and iNOS and COX-2 protein in zebrafish 31
Effects of BEMB and NAC against LPS-induced ROS production in zebrafish 34
Effect of BEMB on LPS-induced NF-kB activity in zebrafish . 37
DISCUSSION . 39
REFERENCES . 42
ACKNOWLEDGEMENT . 47
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
고은이. (2016). Isolation of BEMB from Polysiphonia japonica inhibit LPS-induced pro-inflammatory by preventing ROS production and down-regulating NF-kB in in vitro and in vivo Zebrafish models
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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