Marine-derived bioactive compound regulates obesity through leptin signaling pathway

Abstract

Obesity Overweight and obesity are conditions that results in an abnormal or excessive fat accumulation that might have a negative effect on human health (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/en/). In normal physiological condition, the body weight is maintained by keeping an energy balance between intake and expenditure. Failure of the energy homeostasis, however, increases the body weight, and eventually leads to overweight and obesity (Klok, Jakobsdottir, & Drent, 2007). Body mass index (BMI) is a commonly used parameter to classify overweight and obesity in adults. BMI is defined as a body weight in kilograms divided by the square of height in meters (kg/m2). World Health Organization (WHO) defines overweight and obesity by using following BMI levels; a BMI ≥ 25 is overweight, a BMI ≥ 30 is obesity.

Worldwide obesity rate Recently, obesity is rapidly increasing around the world and that has affected on both gender and age (Sáinz, Barrenetxe, Moreno-Aliaga, & Martínez, 2015). The worldwide prevalence of obesity has more than doubled between 1980 and 2014. According to the WHO report estimated in 2014, more than 1.9 billion adults, aged 18 years and older, were overweight. Among them, over 600 million were found to be obese. By definition, 39% of adults were overweight and 13% of them were obese. Moreover, 42 million children, under the age of 5, were overweight or obese in 2013.

Complications of obesity Obesity is closely associated with various metabolic disorders including dyslipidemia, cardiovascular disease, stroke, insulin resistance, and type 2 diabetes (Zhou & Rui, 2013). Chronic inflammation in adipose tissues may play a critical role in the development of obesity-related metabolic dysfunctions. Thus, obesity increases the risk of developing a variety of pathological conditions, including insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), hypertension, coronary heart disease, ischemic stroke and several cancer conditions. (Ladenheim, 2015), (Jung & Choi, 2014), (R. Yang & Barouch, 2007).

Cause of obesity: imbalance The fundamental cause of obesity and overweight is a long-term energy imbalance between the consumption and expenditure of calories. The energy homeostasis is maintained by two kind of hormones; leptin and ghrelin. Leptin suppresses food intake and thereby induces weight loss. Ghrelin, on the other hand, plays a role in meal initiation (Klok, Jakobsdottir, & Drent, 2007)

Imbalance results in leptin resistance The failure of leptin signaling to suppress food intake and mediate weight loss is commonly referred to as leptin resistance. In this condition, obese individuals do not respond to leptin in an adequate manner (Balland & Cowley, 2015). Thus, high circulating leptin levels are observed in obese human, contrary to theory that absence of leptin leads to obesity (Carter, Caron, Richard, & Picard, 2013; Myers, Cowley, & Münzberg, 2008).

Leptin signaling pathway Leptin, a hormone derived from lep gene, is produced and secreted predominantly from white adipose tissues into the circulation and regulates food intake and energy homeostasis in body (Meister, 2000). The central regulation is mediated through the binding of leptin to its receptor, ObR in central nervous system (CNS) (Roujeau, Jockers, & Dam, 2014). Circulating leptin crosses the blood-brain barrier (BBB) through a receptor-mediated endocytosis mechanism and acts on ObR expressed in distinct regions of brain, including arcuate nucleus (ARC) of the hypothalamus (Crujeiras, Carreira, Cabia, Andrade, Amil, & Casanueva, 2015).

Marine natural products Ocean, covering more than 70% of the earth's surface, is a rich repository of natural resources. Among the total number of species, 80% are living in the ocean ecosystem and are rapidly evolving as an abundant biomass. Moreover, the marine organisms live in an exigent, competitive and aggressive environment that could have resulted in the production of structurally diverse secondary metabolites. These materials include polysaccharides, polyunsaturated fatty acids (PUFA), algal polyphenols, phytocholesterols, pigments, and peptides. The materials have potentials to improve health condition and reduce the risk of diseases. Before several years, a number of novel compounds have been found from marine organisms and their bioactivities have extensively been studied. These marine natural products possess antioxidant, antihypertensive, anti-inflammatory, antidiabetogenic, and anti-cancer activity. These studies are basis for the development of marine organisms as healthy and functional food ingredients.

Phlorotannins Marine organisms are rich sources of structurally diverse bioactive compounds with various biological activities. In particular, brown algae contain a variety of bioactive compounds including phlorotannins, polysaccharides, and pigments. Among them, phlorotannins, polymers of phloroglucinols (1,3,5-trihydroxybenzene), possess a variety of biological activities and potential health benefits such as antioxidant activity (A.-R. Kim, Shin, Lee, Park, Park, Yoon, et al., 2009), anti-diabetic activity (Lee, Kang, Ko, Moon, Jeon, Lee, et al., 2014), (Lee, Kang, Ko, Kang, & Jeon, 2013), antihypertensive effects (Li, Wijesekara, Li, & Kim, 2011), matrix metalloproteinase inhibition effect (M.-M. Kim, Van Ta, Mendis, Rajapakse, Jung, Byun, et al., 2006), and anticancer activity (S. J. Park, Kim, & Jeon, 2012), (Y.-I. Yang, Ahn, Choi, & Choi, 2015). Phlorotannins could have the potential and the possibility to develop new functional foods and pharmaceuticals to improve human health (Li, Wijesekara, Li, & Kim, 2011).

Objectives of the study In this study, we searched for a prospective leptin substitute among natural marine products, and investigated its anti-obesity effects. To select candidates, from marinederived natural products affecting the leptin signaling pathway, an in silico analysis was performed using the crystal structure of the leptin receptor (PDB ID: 3V6O). Among the examined natural marine products, octaphlorethol A (OPA) derived from Ishige sinicola, and pyrogallol-phloroglucinol-6,6-bieckol (PP) derived from Ecklonia cava, brown algae found along the coast of Jeju Island, Korea, favorably docked to the leptin receptor. Of the candidates that favorably docked to the leptin receptor, OPA (0.1 μg/mL) stimulated the leptin signaling pathway, including STAT5, in hypothalamic N1 neuron cell line. To investigate the anti-obesity effects of OPA through the leptin signaling pathway, 0.25 mg/kg OPA was orally administrated to C57BL/6J obese mice fed on a high-fat diet for 4 weeks, and the leptin signaling pathway was analyzed in the brain, white adipose tissues, liver, and muscle. C57BL/6J obese mice treated with OPA showed reduced body weight and food intake compared to that observed in control obese mice. Furthermore, OPA stimulated leptin receptors, and activated phospho- STAT5 in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC). Moreover, OPA activated leptin signaling in all peripheral tissues including white adipose tissues, liver, and muscle. It also reduced the fat size, hepatic steatosis, and regulated glucose metabolism. These results indicate that OPA, a marine-derived bioactive compound, regulates obesity through the leptin signaling pathway in both appetite control via the central nervous system and energy homeostasis via the peripheral nervous system in obese mice fed on a high-fat diet.

현대 질병-비만 서구화된 식습관을 비롯한 운동의 부족, 과도한 업무로 인한 스트레스 등의 사회 적 변화는 다양한 현대 질병을 야기하였다. 체내 에너지 대사의 불균형에 따라 발 생하는 비만, 당뇨, 고혈압과 같은 대사성 질환이 대표적인 현대 질병이다. 특히 비 만은 과거에는 외형적, 미용적 문제로만 여겨졌으나 최근 전 세계적으로 비만 발생 률이 높아지고 있으며, 과체중이나 비만을 넘어서 고도비만에 이르러 문제가 심각 해지면서 점차 질병으로 인식되고 있다. 이에 따라 세계보건기구에서는 비만을 '건 강에 해가 될 정도로 비정상적이거나 과도하게 지방이 축적된 상태'라고 정의하였 으며, '21세기 신종 전염병'이라고 지목하면서 그 위험성에 대하여 경고하고 있다.

비만의 지표 성인의 과체중 또는 비만을 구분하는 지표로서 체질량지수 (Body Mass Index; BMI) 가 가장 보편적으로 사용되고 있으며, 이 수치는 신장(m)의 제곱에 대한 체중 (kg/m2)을 나타낸다. 세계보건기구에서는 인종이나 성별에 관계없이 체질량지수 25 kg/m2 이상을 과체중, 30 kg/m2 이상을 비만으로 정의하였다. 그러나 우리나라를 비롯한 아시아인의 경우 체질량지수 25 kg/m2를 시점으로 비만 관련 질환 발병률 이 1.5~2 배로 증가하며, 그 이하에서도 비만과 연관되어 있다고 알려진 당뇨병 및 심혈관계질환 위험이 나타나고 있다. 또한 동일한 체질량지수에서 서양인에 비해 상대적으로 복부지방과 체지방률이 높다. 따라서 세계보건기구 아시아태평양 지역 과 대한비만학회에서는 아시아인의 과체중의 기준을 체질량지수 23 kg/m2 이상, 비 만의 기준을 25 kg/m2 이상으로 정의하고 있다.

비만 문제의 심각성-비만 유병률 및 비만 합병증 세계보건기구에서 2016년 6월에 발표한 보고에 따르면 2014년에 전 세계 성인 (18세 이상) 19억 명 이상이 과체중이며, 이 중 6억 명 이상이 비만인 것으로 나타 났다. 이는 전 세계 18세 이상 성인의 39%가 과체중이고, 13%가 비만임을 의미한 다. 또한 4천 1만 명의 5세 이하의 어린이들이 과체중 또는 비만인 것으로 나타났 다. 이러한 세계 비만 유병률은 1980년보다 2배 이상 증가한 수치이다. 우리나라의 만 19세 이상 성인의 비만 유병률도 1998년 26.0%에서 2013년 31~32%로 증가하 였고, 특히 남성의 비만 유병률은 35~37%인 것으로 나타나 여성보다 남성의 비만 유병률이 높다고 보고되었다 (2013 국민건강통계, 보건복지부). 한편, 비만 인구의 증가와 함께 제 2형 당뇨병 및 대사증후군의 발병률이 증가하 고 있다. 비만은 인슐린 저항성을 일으켜 대사 합병증인 이상지질혈증, 고혈압, 당 대사 장애, 당뇨병, 죽상동맥경화증, 심혈관계 질환, 뇌졸중, 담낭질환, 신장질환, 간 기능 부전, 근골격계 질환, 관절염, 수면장애, 악성신생물 등의 각종 합병증을 야기 한다. 또한 BMI가 35~40 kg/m2인 경우 사망위험이 정상인보다 2~8 배 높으며, 고 도비만 (> 40 kg/m2)환자의 사망률은 정상인보다 12배 높다.

비만의 치료-비만치료제 비만 치료를 위해서는 생활 습관을 개선하는 생활요법이 가장 중요하지만, 생활 습관 개선이 어렵거나 비만의 정도가 심한 경우, 비만 치료를 돕기 위해 여러 가지 비만치료제가 개발되어 판매되고 있다. 일반적으로 비만치료제는 약물 기전에 따라 크게 지방흡수저해제와 식욕억제제로 구분할 수 있다. 현재 상용되고 있는 비만치료제의 종류로는 1994년 4월에 미국 FDA (Food and Drug Administration)의 승인을 받아 최초로 공인받은 약제로 기록되고 있는 올리스 타트 (Orlistat)와 2012년에 승인을 받은 펜터민/토피라메이트 병합제 (Phentermine/topiramate; Qsymia)와 로카세린 (Lorcaserin; Belviq), 2014년에 승인을 받은 날트렉손/부프로피온 병합제 (Naltrexone/bupropion; Contrave)가 있다. 올리스 타트 (Orlistat)와 함께 기존에 사용되던 시부트라민 (Sibutramine)은 심혈관질환 또 는 당뇨병이 있는 환자를 대상으로 시행한 연구에서 혈압과 맥박을 증가시키고, 관 상 동맥질환, 울혈성 심부전, 부정맥, 뇌졸중 등의 심혈관질환이 발생하는 부작용을 보여, 2010년 10월 이후로 전 세계적으로 사용이 중단되었다. 올리스타트 (Orlistat)는 지방분해효소인 췌장의 라이페이즈 (lipase) 억제제로서 음 식물에 포함된 지방의 분해 및 흡수를 억제한다. 따라서 섭취한 지방의 약 30%는 소화 및 흡수되지 않고 그대로 몸 밖으로 배출된다. 반면, 펜터민/토피라메이트 병 합제 (Phentermine/topiramate)의 펜터민 (Phentermine), 로카세린 (Lorcaserin), 날트 렉손/부프로피온 (Naltrexone/bupropion)은 식욕억제 기전을 갖는 비만치료제이다. 펜터민 (Phentermine)은 흥분성 신경전달물질 분비를 통해 식욕을 억제하는 약물이 고, 로카세린 (Lorcaserin)은 세로토닌 계열의 식욕억제제로서 세로토닌2C수용체 (5- HT2C receptor)에 선택적으로 작용하는 약물이다. 날트렉손과 부프로피온 (Naltrexone/bupropion)은 시상하부와 중뇌 변연계 (Limbic system)의 보상중추에 작용하는 식욕억제제이다.

비만치료제의 부작용 이러한 약물들은 전임상 및 임상연구를 통해 항비만 효과가 검증되어 있지만, 약 물의 기전에 따라 메슥거림, 불면증, 소화 불량, 심혈관질환, 정신질환 등의 여러 가 지 부작용도 나타나고 있다. 또한 올리스타트 (Orlistat)를 제외하고 최근 FDA의 허 가를 받은 비만치료제의 경우, 임상 연구기간이 2년 정도로 짧아 장기간 복용시의 안전성에 대한 연구가 부재한 실정이다. 그럼에도 불구하고 환자의 상태를 고려하 지 않거나, 관리기관의 권고 사항을 무시한 비만치료제의 오남용 또는 과다처방으 로 심각한 부작용의 사례가 발생하고 있다.

현재 상용중인 식욕억제제의 문제점 특히 현재 상용되고 있는 몇몇 식욕억제제는 근본적인 식욕억제 기전을 따르는 약 제가 아니라, 뇌에서 배고픔을 덜 느끼게 하거나, 포만감을 느끼게 하는 기전으로 마약류 (향정신성의약품)로 분류되어 있다. 이는 약제 의존성이나 내성이 발생할 수 있으며, 두근거림, 혈압상승, 가슴통증, 현기증, 불안, 초조, 불면, 흥분 등에서부터 장기간 복용할 경우, 폐동맥 고혈압, 심장실환, 정신분열 등의 심각한 부작용이 나 타날 수 있다.

근본적 식욕억제의 기전-렙틴 (Leptin) 식욕의 항상성은 그렐린 (Ghrelin)과 렙틴 (Leptin)이라는 두 가지의 호르몬이 관여 하는데, 위 (Stomach)에서 분비되는 그렐린 (Ghrelin)에 의해 식욕자극 및 에너지 대 사 억제가 일어나고, 지방 (Fat)에서 분비되는 렙틴 (Leptin)에 의해 식욕억제 및 에 너지 대사가 일어난다. 각 조직에서 그렐린 (Ghrelin) 또는 렙틴 (Leptin)이 분비되면, 뇌의 시상하부에서 식욕 기능을 담당하는 프로오피오멜라노코르틴 (Proopiomelanocortin, POMC) 신경세포와 아구티-관련 펩타이드 (Agouti-related peptide, AgRP) 신경세포에 존재하는 각각의 수용체 (Receptor)에 작용하여 신호를 일으킨다. 대개의 비만 환자의 경우, 혈중 렙틴 (Leptin)의 수치가 정상범위를 초과 하는 렙틴저항성 (Leptin resistance)을 나타낸다. 이는 지방세포에서 분비된 렙틴 (Leptin)이 렙틴 수용체에 결합하고, 그 신호가 세포 내로 전달되는 각 단계에서의 구조적 결함에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 그러나 렙틴저항성 (Leptin resistance)이 식욕 억제를 방해하고 비만을 유발하는 중요한 원인임에도 불구하고 이를 개선하는 비만 치료제 연구 개발이 부족한 실정이다.

식의약소재로서의 해양생물자원의 가치 해양은 지구 전체 면적의 70%를 차지하고 있으며, 지구 생물종의 80%가 해양에 서식하는 생물 자원의 보고이다. 또한 해양생물은 육상생물과는 전혀 다른 환경에 서 서식하여 다양한 자기방어 기제로 구조적으로 특이하고 다양한 2차 대사산물을 생산한다. 이러한 천연물은 합성 의약품과 달리 부작용이 없기 때문에 최근 신의약 품 소재 개발 연구에 활용되고 있다. 해조류에는 미네랄, 비타민, 다당류 및 폴리페놀이 풍부하게 함유되어 있다. 특히 해조류의 폴리페놀은 항산화, 항암, 항염, 항염증 등 다양한 활성 성분이 알려져 있 다. 하지만 육상식물 유래의 폴리페놀의 대사성질환 치료제, 비만, 당뇨, 고혈압에 대한 치료제로써의 연구는 다양한 방면에서 연구되고 있으나 해조류에서의 폴리페 놀의 대사성 질환 치료제로써의 연구는 미흡한 실정이다.

연구의 목적 따라서 이 연구에서는 비만 개선 및 치료물질로서 렙틴/렙틴리셉터의 작용을 이용 한 해양 천연물 유래 신의약 소재를 탐색하였다. 이를 위하여 제주 자생 해조류에 서 분리된 다양한 플로로탄닌 (phlorotannin) 계열의 컴파운드를 대상으로 leptin signaling pathway를 통한 항비만 효과를 검증하여 기능성 의약품 소재로서의 개발 가능성을 확인하였다. Part 1에서는 in silico study를 통하여 총 13가지 컴파운드를 대상으로 Leptin receptor의 결합부위에 대한 ligands 결합 친화도 (docking energy)를 비교 분석하 였으며, 이 중 가장 높은 결합 친화도를 나타내는 컴파운드를 선정하였다. 또한 선 정된 컴파운드의 leptin signaling pathway를 통한 식욕억제 효과를 검증하기 위하여 Leptin signal이 일어나는 주요 세포인 hypothalamic N1 neuron cell을 실험에 사용 하였다. Part 2에서는 Part 1의 연구결과로 선정된 compound의 Leptin signal을 통한 식욕 억제 효과를 in vivo study로서 검증하였다. 동물은 C57BL/6J를 사용하였고, 총 10주 의 실험 기간 동안 45 kcal 고지방 사료를 급이하여 비만을 유도하였다. 사료 급이 6주 후부터는 선정된 compound를 2.5 mg/kg으로 매일 경구투여하였다. 실험 종료 후, 동물을 희생하여 식욕억제 신호가 일어나는 조직인 뇌를 분리 적출하여 leptin signal의 중요한 molecules의 변화를 확인하였다. Part 3에서는 Part 1의 연구결과로 선정된 compound의 Leptin signal을 통한 말초 조직의 에너지 대사 조절 효과를 in vivo study로 확인하였다. 동물은 C57BL/6J를 사용하였고, 총 10주의 실험 기간 동안 45 kcal 고지방 사료를 급이하여 비만을 유 도하였다. 사료 급이 6주 후부터는 선정된 compound를 2.5 mg/kg으로 매일 경구 투여하였다. 실험 종료 후, 동물을 희생하여 에너지 대사가 일어나는 조직인 백색 지방, 간, 근육을 분리 적출하였다. 이후, 지방의 크기, 지방간염, 근육 조직 등을 확인함으로써 에너지 대사의 조절을 확인하였으며, 렙틴 신호의 변화를 확인함으 로써 에너지 대사와 렙틴 신호의 상호작용을 확인하였다.