구멍갈파래(Ulva pertusa)의 세균군집구조 분석 및 항균활성 탐색

Abstract

이 논문은 제주도에서 채집한 구멍갈파래(Ulva pertusa)를 Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)를 이용하여 세균군집을 조사하고, 분리된 균주로 어류질병세균과 인체유해세균에 대해 항균활성을 평가하였다. Marine agar배지와 R2A배지를 사용하여 총 145개의 배양 가능한 미생물이 분리 되었으며 RFLP 분석을 위해 DNA를 추출하고 27F와 1522R primer를 사용하여 16S rRNA를 증폭하였다. 증폭된 16S rRNA를 제한효소 HaeⅢ와 RsaⅠ을 이용하여 RFLP 분석을 실시하였다. RFLP 패턴 결과로부터 총 104개의 균주를 선별하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석하였고, 분석된 염기서열을 NCBI Genbank database와 EzTaxon server에서 가장 유사한 염기서열을 비교·분석하였다. 그 결과, 이미 알려진 균주의 염기서열과 91% 이상의 유사도를 보였다. 주요 계통군으로 Proteobacteria (α-proteobacteria, β-proteobacteria, γ-proteobacteria) (63%), Bacteroidetes (22%), Firmicutes (11%), Actinobacteria (4%)로 4개의 문이 관찰되었고, 7개의 강, 13개의 목, 18개의 과, 27개의 속이 관찰되었다. 계통학적 분석 결과, 12균주가 97% 이하의 상동성으로 나타나 새로운 속이나 종으로 분류될 가능성이 높게 나타났다. 104개의 균주의 상층액과 균체를 사용한 항균활성은 각 각 21개, 14개로 활성을 보였다. 대부분의 균주들은 그람양성균에 비교하여 그람음성균에 강한 활성을 보였다. 분리된 균주 중 UR11T균주를 신종후보균주라 추정하고 분류동정을 하였다. UR11T균주는 그람음성, 간균으로 노란색 집락을 띄었으며 최적생장은 NaCl이 포함되지 않은 R2A배지에서 25°C, pH 7.0이였다. 16S rRNA 염기서열 분석에 따라 F.jenuensis EC11T과 98%의 가장 높은 상동성을 보여 Type strain으로 선정하여 실험을 진행하였다. UR11T균주의 주요 퀴논은 MK-6이고 F. jenuensis EC11T과 비교되는 효소활성 및 기질이용성을 보였으며, 주요 세포막의 극성지질로는PE(phosphatidylethanolamine), AL (unknown aminolipids), PL (unknown aminopolarlipids), L (unknown lipids)로 확인되었으며, 주요 지방산으로는 iso-C15:0 (33.9%), iso-C15:1G (12.4%), iso-C17:0 3-OH (9.0%), iso-C16:0 (7.0%)와 iso-C15:03-OH (6.3%)로 나타났다. DNA-DNA hybridization 결과, F. jenuensis EC11T와 58%의 상동성을 보여 신종으로 생각되어, KCTC (=KCTC 52377T)와 JCM (=JCM 31512T)에 기탁을 하였다.

The present study was carried out to evaluate the diverse bacterial community in association with Ulva pertusa, the sea weed collected in and around Jeju Island, by Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) marker method. About 145 bacterial strains associated with Ulva pertusa were screened and cultured in Marine agar and R2A agar. The 16S rRNA gene fragment from all the isolated strains were cut with molecular scissors like HaeIII and RsaI restriction enzymes and based on their restriction pattern each isolates were classified into different groups. Selected strains showed more than 91% 16S rRNA gene sequence similarity with that of known bacterial species which include 4 phyla namely proteobacteria (63%), firmicutes (11%), actinobacteria (4%) and bacteroidetes (22%) along with 7 classes (actinobacteria, flavobacteriia, cytophagia, bacilli, α-proteobacteria, β-proteobacteria, γ-proteobacteria), 13 orders, 18 families, and 27 genera. Present results confirmed the broad spectrum of diversified bacterial communities were in association with Ulva pertusa when compared with other regions. About 12 strains, which shows <97% 16S rRNA sequence similarity to previously identified bacteria, could be identified as noble species. However more experiments on morphological, physiological, and biochemical indices are further needed to confirm the novelty. Among 104 strains, the supernatant and pellet of 21 and 14 strains respectively, showed antimicrobial activity. particularly, most strains showed strong activity against Gram - negative bacteria than Gram - positive bacteria. A bacterial strain, labeled UR11T was isolated from green alga Ulva pertusa collected from Jeju Island, Korea. UR11T was identified as a gram-negative, rod-shaped, motile by gliding and aerobic bacterial strain with yellow colonies on R2A plates. The strain UR11T grew over at temperature range of 10°C to 30°C (optimally at 25°C), a pH range of 6.0-11 (optimally at pH 7.0) and a Nacl range of 0.5-5% Nacl (w/v). Hydrolyses DNA, casein, tween 40 and tween 60, but not hydrolyses cellulose, starch, tween 20, tween 80. Phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences revealed that strain UR11T was a member of the genus Flavobacterium. Strain UR11T shared close similarity with Flavobacterium jejuensis EC11T(98.0%) Flavobacterium jumunjinense HME7102T(96.11%), Flavobacterium haoranii LQY-7T(95.27%), Flavobacterium dongtanense LW30T(95.08%), and Flavobacterium ahnfeltiae 10Alg 130T(94.91%). The major fatty acids (>5%) were iso-C15:0(33.93%), iso-G15:1(12.40%), iso-C17:03OH(8.96%), iso-C16:0(7.00%) and iso-C15:03OH(6.34%). The major polar lipids were phosphatidylethanolamine, seven unknown aminolipids, two unknown aminopolarlipids and two unknown lipids. Based on phenotypic, chemotaxonomic and phylogenetic evidence, strain UR11T represents a novel species of the genus Flavobacterium. The type strain is Flavobacterium sp.UR11T (=KCTC 52377T =JCM 31512T).