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Anti-cancer effects of apigenin by enhancing tumor necrosis factor-related apotosis-inducing ligand-mediated death receptor 5 expression and inhibition of telomerase activity

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Abstract
Apigenin은 암세포의 증식, 이동능, 신생혈관생성을 억제 하고 세포사멸사를 유도 하는 것으로 알려졌으나, TRAIL이 유도하는 암세포 사멸사와의 연관 관계에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 게다가 apigenin 처리에 의한 telomerase의 활성 변화와 암세포의 세포사멸사간의 상호 작용에 대한 연구는 아직 명확 하게 밝혀지지 않았다. 이 연구에서는 Hep3B와 HepG2 암세포를 이용하여 apigenin이 TRAIL이 유도하는 세포사멸사를 강화하고, 백혈병 세포주를 이용하여 caspase 단백질 활성을 통한 세포사멸사를 확인하였다. Chapter 1. Apigenin은 DR5의 발현을 증가 시켜 TRAIL이 유도하는 세포사멸사를 강화시켰다. 이번 연구 결과의 흥미로운 점은 apigenin은 ROS의 생산을 증가 시켰지만 ROS억 제제와 apigenin, TRAIL을 병행 처리 하자 더욱 강한 세포사멸사를 유도 하였다. 이 결과는 apigenin에 의해 생산된 ROS가 세포를 보호하여 TRAIL에 의한 죽음으로부터 생존할 수 있게 도와 주었음을 의미한다. 우리의 연구결과는 apigenin에 의해 생산된 ROS가 autophagy의 활성을 유도하여 세포를 보호했음을 보여 주었다. Apigenin과 TRAIL이 유도하는 세포사멸사는 autophagy 억제제인 3-MA에 의해 더욱 강하게 증가하였다. 그리고 그 증가 폭은 apigenin과 TRAIL, ROS 억제제를 처리하여 유도된 세포사멸사의 수치와 거의 일치하였다. 이 결과는 apigenin이 DR5의 발현을 증가시켜 TRAIL이 유도하는 세포사멸사를 강화 시키지만, 한편으로는 ROS생성을 통해 autophagy의 활성을 유도하여 세포를 보호하기도 함을 보여 준다. Chapter 2. Apigenin의 처리는 백혈병 세포주인 THP-1, U937, HL-60 세포에서 강한 세포사멸사를 유도하였다. Apigenin이 생성한 ROS와 세포사멸사간의 관계를 규명하고자 apigenin과 ROS 억제제인 NAC과 GSH를 병행 처리하였다. NAC과 GSH는 apigenin이 생산하는 ROS의 생산을 억제 하였으나 세포사멸사 유도에 대한 결과에는 별다른 변화가 없었다. 따라서 우리는 세포사멸사를 유도하는 다른 원인인 telomerase의 활성 변화를 확인하였다. 그 결과 apigenin은 telomerase의 활성을 억제하였고, 이는 hTERT의 발현 억제를 통한 것임을 확인 하였다. 이러한 hTERT의 발현 억제는 c-Myc의 활성 억제를 통한 것으로서 apigenin의 처리는 c-Myc의 전사인자로서의 활성을 억제 할 뿐만 아니라 c-Myc의 발현 역시 억제 하는 것으로 확인 되었다. 하지만 ROS억제제의 처리는 apigenin이 유도하는 c-Myc의 활성을 억제 하지 못하였으며, telomerase의 활성역시 억제 하지 못하였다, 결론 적으로 apigenin이 유도하는 c-Myc 활성 조절에 매개한 telomerase 활성 억제 효능은 apigenin이 생산한 ROS와는 연관이 없음을 규명하였다. 종합적으로 우리는 이번 연구에서 apigenin은 DR5의 발현 증가와 c-Myc의 활성 억제를 통하여 암세포 사멸 효과를 유도 하지만, 한편으로는 ROS 생산을 유도 함으로서 세포 보호 효과를 확인 하였다. 이러한 apigenin의 성질을 이용하여 획기적인 암세포의 특이적 항암 치료제를 개발 할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서 이후 연구에서는 apigenin이 유도하는 ROS와 autophagy, telomerase활성에 대해 상관 관계를 규명하는 연구를 진행하고자 한다.
Apigenin is known to suppress in cancer cells proliferation, angiogenesis, motility, and induce
apoptosis; however, it is little known whether apigenin triggers tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)-induced apoptosis. In addition, the underlying relationship between apoptosis and telomerase activity in response to apigenin exposure is not well understood. In this study, we found that apigenin enhances TRAIL-induced apoptosis in hepatocarcinoma cells (Hep3B and HepG2) and human leukemia cells (U937, THP-1 and HL60) by inducing caspase activation. These results were found to increase of death receptor 5 (DR5) expressions and inhibition of telomerase activity. As shown in previous studies, apigenin increased reactive oxygen species (ROS) production, however, intriguingly; ROS inhibitors sensitize combined treatment with apigenin and TRAIL-induced apoptosis, intimating that apigenin-induced ROS produces weaker cell survival signal than apoptotic one. Furthermore, we found elevated reactive oxygen species (ROS) generation following apigenin treatment. And then, apigenin-induced ROS was protection of cell death. Our results shown that apigenin-induced ROS-mediated cell protection effects was activation of autophagy. TRAIL-induced apoptosis greatly increased by specific autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA). Taken together, these finding revealed that apigenin enhanced TRAIL-induced apoptosis, while on the other hand apigenin protects the apoptosis by increasing the ROS-mediated autophagy. We further showed that apigenin downregulates telomerase activity in caspase-dependent apoptosis and observed that apigenin dosing results in down regulation of telomerase activity via inhibition of c-Myc-mediated telomerase reverse transcriptase (hTERT) expression. Be sides, treatment of apigenin cells with the two ROS inhibitors did not restore telomerase activity. We conclude that apigenin enhanced TRAIL-induced apoptosis by regulation of DR 5 expression and the loss of telomerase activity.
Author(s)
강창희
Issued Date
2017
Awarded Date
2017. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000008026
Alternative Author(s)
Chang-Hee Kang
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
김기영
Table Of Contents
Abstract ⅰ
국문요약 .ii
List of figure . ⅳ
Chapter Ⅰ. Coexistence of cell death and cell survival signals in apigenin-mediated sensitization of
tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand . 1
Abstract 2
1. Introduction 3
2. Materials and Methods 5
2.1. Reagents and methods 5
2.2. Cell culture and viability . 5
2.3. Isolation of total RAN and RT-PCR . 6
2.4. Western blot analysis . 6
2.5. Detection of apoptosis 6
2.6. Measurement of ROS . 7
2.7. DNA fragmentation assay 7
2.8. Flow cytometric analysis of DR5 . 7
2.9. Statistical analysis 8
3. Results 9
3.1. Apigenin sensitizes Hep3B and HepG2 cell towards TRAIL-induced apoptosis . 9
3.2. Apigenin activates caspase and antiapoptotic proteins during TRAIL sensitization 11
3.3. Apigenin induces expression of DR5, causing to TRAIL-mediated apoptosis . 13
3.4. Apigenin-induced ROS protected TRAIL-induced apoptosis 15
3.5. Apigenin transmits autophagy-mediated cell survival signal by generating ROS 17
4. Discussion 19
5. References 21
Chapter II. Apigenin decrease cell viability and telomerase activity in human leukemia cell lines . 25
Abstract 26
1. Introduction 27
2. Materials and Methods 29
2.1. Reagents and antibodies . 29
2.2. Cell lines and culture 29
2.3. Cell culture and viability 29
2.4. Flow cytometric analysis . 30
2.5. Measurement of ROS . 30
2.6. DNA fragmentation assay 30
2.7. Western blot analysis . 31
2.8. Telomerase activity assay 31
2.9. RNA extraction and RT-PCR . 31
2.10. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) 32
2.11. Statistical analysis 33
3. Results 34
3.1. Apigenin decreases leukemia cell viability 34
3.2. Apigenin induces apoptosis via a caspase-dependent pathway 36
3.3. ROS is not a main regulator in apigenin-induced apoptosis 38
3.4. Apigenin suppresses telomerase activity and hTERT transcriptional level 40
3.5. Apigenin suppresses c-Myc expression in leukemia cancer cells . 42
4. Discussion 45
5. References 48
Degree
Doctor
Publisher
제주대학교 일반대학원
Citation
강창희. (2017). Anti-cancer effects of apigenin by enhancing tumor necrosis factor-related apotosis-inducing ligand-mediated death receptor 5 expression and inhibition of telomerase activity
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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