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Preparative isolation and identification of functional compounds from Pyropia yezoensis and evaluation on their biological effects

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Abstract
방사무늬김은 예로부터 동양아시아인 한국, 중국, 일본 등 에서 양식되어 오면서, 식품 및 의약소재로 널리 이용되고 있는 식용 해조류이다. 이들은 황산기 다당류인 포피란, 글라이코프로테인 및 파이코에리스린인 기능성 단백질 등 다양한 기능성 성분이 풍부하여, 항산화, 항암, 항염 및 항당뇨 등 다양한 효능이 규명되어 왔다. 하지만 대부분의 연구가 상대적으로 함량이 높은 단백질(30~40%) 및 다당류(40~50%) 에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔으나, 그 외 성분에 대한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 우리나라에서 양식되고 있는 주요 품종인 방사무늬김(Pyropia yezoensis)으로부터 항염증 및 항당뇨 성분에 대한 규명을 수행하였다.
1. 방사무늬김 유래 추출물에서 각 n-hexane, chloroform (CHCl3), ethyl acetate (EtOAc), water 분획물로 나누었으며, 기존 보고에서 항염증 및 항당뇨 효능 및 성분에 대한 알려진, n-hexane 분획물을 제외한 CHCI_(3) (PYC) 및 EtOA_(c) (PYE) 분획물에 대한 lipopolysaccharide (LPS)에 의해 염증반응이 유도된 마우스 대식세포인 Raw 264.7 cell내 염증메게체인 nitro oxide (NO)에 감소효능을 평가한 결과, PYC 및 PYE에서 각각 16.88 μg/ml 과 10.40 μg/ml의 IC50 값을 나타내었다. 그리고 항당뇨 평가에서 alloxan에 의해 췌장이 파괴된 zebrafish에 2% glucose를 처리하였을 때 무처리 군에 비해 혈중 glucose 함량이 크게 증가하였으며, PYC 및 PYE 0.5~2μg/ml에서 농도 구배적으로 혈중 glucose 함량을 낮추었다. 따라서, 먼저 PYC에서 항염증 및 항당뇨 효능을 갖는 성분을 규명하기 위하여, 항염증은 LPS에 의해 대식세포에 생성된 NO 생성 억제능으로 평가하였으며, 항당뇨 효능은 근원섬유세포인 C2C12내 glucose 함량과 zebrafish 혈중 내 glucose 함량을 측정하여 평가하였다. PYC는 silica column을 EtOAc (PYCE) 과 MeOH (PYCM) 분획물로 나누었다. 해조류내 CHCl3 분획물에는 일반적으로 지방산, 지용성 색소체, 스테롤 및 폴리페놀 등의 기능성 성분이 있다고 알려져 왔으며, 특히 폴리페놀과 스테롤은 항산화, 항염, 항암, 항당뇨 및 항비만 등 매우 다양한 효능이 있다고 보고되어 왔다. 따라서 이 연구에서는 방사무늬김 에탄올 추출물유래 PYC에서 타깃성분에 대한 확인을 위하여 total phenol 및 total sterol 함량을 측정한 결과 PYCE에서 28%의 높은 스테롤 함량을 보였으며, total phenol 함량의 경우에는 모든 분획물에서 5% 이하의 낮은 함량을 보였다. 따라서 PYCE내 주요 기능성 성분으로 sterol을 타깃으로 설정하였으며, 이들의 유리화된 형태의 생성을 위하여 saponification 공정을 수행하여 PYCES를 획득하였다. 상기에서 획득한 모든 분획물에 대한 항염증 및 항당뇨 in vitro, in vivo 효능을 평가한 결과 PYCES에서 전체적으로 가장 우수한 효능을 보였다. 홍조류내 스테롤 성분에는 desmosterol이 80%이상 차지하고 있으며, 그 외는 cholesterol, stigmasterol, campesterol등이 알려져 있다. 우리는 Silica TLC를 통해 PYCE내 총 5개의 스테롤 성분을 확인하였으며, 이중 기존에 알려진 desmosterol과 cholesterol로 확인되었으며, 그 외 성분은 기존에 알려진 성분과는 다른 스테롤로 확인되었다. 따라서 그 외 성분은 PYCES1~3으로 설정하였으며, liquid liquid chromatography의 일종인 고속원심분배크로마토 그래피를 이용한 이들의 분리정제를 위하여 최적 분배조건을 수립하였다. 9:1:9:1(n-Hexane:EtOAc:MeOH:Water) ~ 6:4:6:4 용매 조건에서 최적 분배 조건을 확인한 결과, PYCES1, desmosterol 및 cholesterol은 9:1:10:1 조건으로 확립되었으며, PYCES2 및 3는 5:5:7:3 조건으로 확립되었다. 따라서 다음과 같은 조건을 적용한 CPC를 이용하여 5개의 물질을 분리하였으며, 그들은 preparative TLC를 통하여 각각 정제되어 사용되었다. 기존에 알려진 desmosterol과 cholesterol을 제외한 PYCES1~3에 대한 항염증 효능을 평가한 결과 PYCE2, 3이 독성이 없는 상태에서 높은 항염증 효능을 보였으며, 항당뇨 in vitro, in vivo 효능평가에서는 PYCES3이 가장 우수한 항당뇨 효능을 보였다. 따라서 전체적으로 가장 우수한 항염증 및 항당뇨 효능을 보인 PYCE3에 대한 구조 규명을 위해 GC-MS와 MS/MS, NMR 분석을 진행하였다. GC-MS 분석 결과26,27-Dinorergosta-5,23-dien-3-ol과 82%의 유사성을 보였으며, ^(13)C NMR 분석 결과 PYCES3은 27개의 carbon 수를 갖는 것으로 확인되었다. 따라서 기존 연구 보고와 NMR 분석 결과 26,27-Dinorergosta-5,23-dien-3-ol 을 기본골격으로 하는 10,13-dimethyl-17-(6-methylheptan-2-yl)-2,3,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol로 확인되었다. 이들에 대한 염증성 cytokines에 대한 생성억제 효능을 평가한 결과 염증성 매게 채인 COX-2에 의해 생성되는 PGE2 는 PYCES3에 의해 강력하게 억제 되었으며, 염증 및 암 생성 cytokine인 IL-6는 농도구배적으로 억제되었다. 그 외 염증성 cytokine인 IL-1β는 50μg/ml에서 억제되었다.
2. PYC외 항염증 및 항당뇨 평가에서 우수한 효능을 보인 PYE에서도 기능성 성분을 규명하기 위하여 PYE를 silica column을 사용하여 EtOAc (PYCE) 과 MeOH (PYCM) 분획물로 나누었다. 항염증 효능은 LPS에 의해 대식세포에 생성된 NO 생성 억제 능으로 평가하였으며, 항당뇨 효능은 근원섬유세포인 C2C12내 glucose 함량과 alloxan에 의해 췌장이 파괴된 zebrafish 혈중내 glucose 함량을 측정하여 평가한 결과, PYE, PYEE 및 PYEM 중 에서 PYEE가 가장 우수한 항염증 및 항당뇨을 나타내었다. 따라서, 이 연구에서는 방사무늬김 유래 PYE에서 타깃성분에 대한 확인을 위하여 항염증 및 항당뇨 효능이 가장 좋은 PYEE를 TLC와 HPLC 분석을 한 결과 다량의 색소채가 함유된 것을 확인하였고, 그 외에 지방산과 극성의 화합물이 함유된 것을 확인을 하였다. PYEE로부터 활성물질을 분리 하기 위해 open column chromatography를 사용하였고, 이동상 용매인 MeOH의 비율을 20, 70 100% 비율로 순차적으로 올리며 총 7개의 분획물 (PYEE1~7)을 얻었다. PYEE로부터 얻어진 7개의 분획물에 대한 항염증 및 항당뇨 in vitro, in vivo 효능을 평가한 결과 PYEE6이 전체적으로 가장 우수한 효능을 보였다. PYEE6을 HPLC로 분석한 결과 다량 극성화합물이 함유된 것을 확인 하였고, TLC 분석을 통하여 최적의 분리 조건을 설정한 결과, 이동상 용매의 비율을 55% MeOH로 설정을 하여 open column chromatography 분리정제를 한 결과, 총 2개의 화합물 PYEE6-1, 6-2를 분리하였으며, 그들은 preparative TLC를 통하여 각각 정제되어 사용되었다. PYEE6-1, 2에 대한 항염증 효능을 평가한 결과 PYCE1, 2 모두 독성이 없는 상태에서 높은 항염증 효능을 보였으며, 및 항당뇨 in vitro, in vivo 효능평가에서도 PYEE6-1, 2 모두 우수한 항당뇨 효능을 보였다. 따라서, PYEE6-1, 2 두 개의 화합물에 대한 구조 규명을 위해 GC-MS와 MS/MS, NMR 분석을 통해 진행하였다. 먼저 PYEE6-1의 GC-MS 분석 결과 1,21,2 -Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 -ethylhexyl) ester ethylhexyl) esterethylhexyl) ester ethylhexyl) ester ethylhexyl) ester ethylhexyl) ester 와 97%의 유사성을 보였으며 NMR 분석 결과 PYEE6-1와 1,21,21,2-Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic Benzenedicarboxylic acid, mono(2 acid, mono(2acid, mono(2acid, mono(2 acid, mono(2 acid, mono(2 -ethylhexyl) esteethylhexyl) este ethylhexyl) esteethylhexyl) este ethylhexyl) este ethylhexyl) este ethylhexyl) ester은 동일한 화합물로 확인되었다. 1,21,21,2-Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 Benzenedicarboxylic acid, mono(2 -ethylhexyl) esterethylhexyl) ester ethylhexyl) esterethylhexyl) ester ethylhexyl) ester ethylhexyl) ester ethylhexyl) ester 은 Polygonum Polygonum Polygonum Polygonum Polygonum chinensechinense chinense chinense 내에서 내에서 존재하는 천연물로 천연물로 , 보고 된 효능으로는 효능으로는 항균효과 항균효과 정도 만이 보고되어있다 보고되어있다 보고되어있다 . 이어서, PYEE6-2의 GC-MS 분석 결과 3,4-dichloro[1,6]naphthyridine $$ pyrido[4,3-B]pyridine, 3,4-dichloro 와 79%의 유사성을 나타냈으며, 이 성분에 대한 효능 보고는 전무 하였다.
Author(s)
김형호
Issued Date
2017
Awarded Date
2017. 2
Type
Dissertation
URI
http://dcoll.jejunu.ac.kr/jsp/common/DcLoOrgPer.jsp?sItemId=000000008061
Alternative Author(s)
Hyung-Ho Kim
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
국문초록 V
LIST OF FIGURES X
LIST OF TABLES XIII
INTRODUCTION 1
Part I. Identification of chemical structure of anti-inflammatory and anti-diabetes compounds from chloroform fraction of Pyropia yezoensis 6
1. ABSTRACT 6
2. MATERIALS AND METHODS 7
2.1. Materials 7
2.2. Apparatus 7
2.3. Preparation of crude sample from P. yezoensis 8
2.4. Preparation of two-phase solvent system 8
2.5. CPC separation procedure 8
2.6. HPLC analysis 9
2.7. Cell culture 9
2.8. Determination of nitric oxide (NO) production 11
2.9. Measurement of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-1β) and PGE2 production 11
2.10. Glucose uptake assay 11
2.11. Experimental animals 11
2.12. Measurement of blood glucose level 12
2.13. GC/MS analysisGC/MS analysisGC/MS analysisGC/MS analysis GC/MS analysis GC/MS analysisGC/MS analysisGC/MS analysis GC/MS analysis 12
2.14. 1H-NMR and 13C -NMR analysis of purified compound 13
2.15. Statistical analysis 13
3. RESULTS AND DISCUSSIONS 13
3.1. Total phenolic content of each fraction of PYC 13
3.2. Total sterol content of each fraction of PYC 14
3.3. Thin layer chromatographic (TLC) analysis of each fraction of PYC 14
3.4. NO inhibitory effects of each fraction of PYC 15
3.5. Glucose uptake effect of each fraction of PYC in C2C12 myotube 16
3.6. Blood glucose levels inhibitory effects of each fraction of PYC in alloxan stimulated diabetic zebrafish 17
3.7. Optimization of the two-phase solvent system 17
3.8. Separation of compounds by CPC 23
3.9. NO inhibitory effects of the compounds from PYCES 27
3.10. Glucose uptake effect of the compounds from PYCES in C2C12 myotube 27
3.11. Blood glucose levels inhibitory effects of the compounds from PYCES in alloxan stimulated diabetic zebrafish 27
3.12. Structural identification of anti-inflammatory compounds from PYCES 28
3.13. PYCES3 inhibited release of PGE2, and decreased pro-inflammatory cytokines released by LPS-stimulation in RAW 264.7 macrophages 28
4. CONCLUSION 35
Part II. Identification of chemical structure of anti-inflammatory and anti-diabetes compounds from ethyl acetate fraction of Pyropia yezoensis 36
1. ABSTRACT 36
2. MATERIALS AND METHODS 37
2.1. Materials 37
2.2. Apparatus 37
2.3. Preparation of crude sample from P. yezoensis 38
2.4. HPLC analysis 38
2.5. Cell culture 38
2.6. Determination of nitric oxide (NO) production 40
2.7. Measurement of pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-1β) and PGE2 production 40
2.8. Glucose uptake assay 40
2.9. Experimental animals 41
2.10. Measurement of blood glucose level 41
2.11. GC/MS analysisGC/MS analysisGC/MS analysisGC/MS analysis GC/MS analysis GC/MS nalysisGC/MS analysis GC/MS analysis 41
2.12. 1H-NMR and 13C -NMR analysis of purified compound 42
2.13. Statistical analysis 42
3. RESULTS AND DISCUSSIONS 42
3.1. Thin layer chromatographic (TLC) analysis of each fraction of PYE 42
3.2. HPLC analysis of each fraction of PYE 43
3.3. NO inhibitory effects of each fraction of PYE 46
3.4. Glucose uptake effect of PYE, PYEE and PYEM in C2C12 myotube 46
3.5. Blood glucose levels inhibitory effects of each fraction of PYE, PYEE and PYEM in alloxan stimulated diabetic zebrafish 47
3.6. Reverse phase open column fractionation of the PYEE 47
3.7. NO inhibitory effects of each fraction of PYEE 48
3.8. Glucose uptake effect of PYEE in C2C12 myotube 48
3.9. HPLC analysis of PYEE6 48
3.10. Thin layer chromatographic (TLC) analysis of PYEE6 49
3.11. Reverse phase open column fractionation of the PYEE6 49
3.12. NO inhibitory effects of the compounds from PYEEF6 49
3.13. Glucose uptake effect of the compounds from PYEEF6 in C2C12 myotube 50
3.14. Structural identification of anti-inflammatory compounds from PYEE6 50
3.15. PYEE6-1 and 2 inhibited release of PGE2, and decreased pro-inflammatory cytokines released by LPS-stimulation in RAW 264.7 macrophages . 58
4. CONCLUSION 68
REFERENCE 69
ACKNOWLEDGEMENT 75
Degree
Master
Publisher
제주대학교 일반대학원
Citation
김형호. (2017). Preparative isolation and identification of functional compounds from Pyropia yezoensis and evaluation on their biological effects
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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