Taxonomic Study of Muridae and Phylogenetic Relationship of Mus and Rattus in Nepal Inferred to Mitochondrial DNA Cytochrome B (CytB) Gene

Abstract

In the current study, taxonomy of murids occurring in three locations Lumbini, Pokhara, and Kathmandu of Nepal have been studied using both morphological and molecular analyses. Morphological identification of murids was carried out by assessing the external morphology including fur color, footpad, tail, ear, external genitalia, and pairs of mammary glands in females and measuring the external body. Altogether, five species namely Bandicota bengalensis, Mus booduga, Niviventer fulvescens, Rattus pyctoris, and Tatera indica were identified using morphological analysis. However, four species M. musculus, R. nitidus, R. rattus and R. tanezumi could not identify through morphological analysis. The morphological traits were compared between two species R. rattus and R. tanezumi but there were no consistently discernible coat color differences to distinguish them. Also, there was no significant difference in morphometric measurement (Student t-test, n=52, df=50, p>0.05). These two species were distinguished with R. nitidus and R. pyctoris by tail length and tail color, respectively. Similarly, the morphology of M. musculus was compared between collection from different locations Lumbini and Pokhara. They were distinguished by coat color but there was no significant difference in morphometric measurement (Student t-test, n=23, df=21, p>0.05). Molecular identification was carried out using mitochondrial DNA (mtDNA) Cytochrome B (CytB) gene sequences and successfully identified eight taxa (B. bengalensis, M. booduga, M. musculus, N. fulvescens, R. nitidus, R. rattus, R. pyctoris, and R. tanezumi) in species level and one taxon (Mus sp.) at genus level. The molecular data generated in this study was also used to distinguish intraspecific and inter specific variations. CytB haplotypes were determined in all taxa and found altogether forty-four unique haplotypes in 114 CytB sequences of murids. The M. booduga (2), M. musculus (6), Mus sp. (2), R. nitidus (4), and R. rattus (26), occupied multiple haplotypes but B. bengalensis, N. fulvescens, R. pyctoris and R. tanezumi occupied a single haplotype in this study. Genetic distances were computed among conspecific haplotypes of R. rattus, M. musculus, R. nitidus, and M. booduga, which were ranged 0.001-0.017, 0.001-0.016, 0.001-0.008 and 0.001-004, respectively. Genetic distances were also computed between nine identified murids and found highest genetic distance between B. bengalensis and M. musculus (0.278) and lowest genetic distance between R. rattus and R. tanezumi (0.048). Phylogenetic studies of two genera Mus and Rattus was carried using CytB gene sequences. Phylogenetic tree (neighbor joining tree, NJ tree) was constructed based on the genetic distance between the haplotypes of intrageneric species. Three Mus taxa M. musculus, M. booduga and Mus sp. were found to be clustered in two species groups (M. musculus species group and M. booduga species group) of subgenus Mus. Former one was in M. musculus species group and later two were in M. booduga species group. The phylogenetic analysis of M. musculus revealed that the haplotypes sequences of mtDNA CytB gene distinguished into two distinct clades on a NJ tree representing two subspecies, M. m. bactrianus and M. m. castaneus in Pokhara and Lumbini, respectively. The divergence time estimation between these two subspecies showed they were diverged approximately, 0.68 million years before present (MYBP). Phylogenetic analysis suggested two population of M. booduga abundant in Nepal and India are occurring in two different lineages. Although the Mus sp. could not identify at species level but phylogenetic analysis revealed it has close genetic relation with M. nitidulus recorded in Myanmar. Phylogenetic relationship was studied on four species of Rattus identified in this study. The R. rattus abundant in Nepal has a close genetic relation with R. rattus found in Pakistan and have been clustered together in a group at the phylogenetic tree. Genetically, these two populations are close with South Indian population of R. rattus, which were estimated to be diverged about 2.097-2.344 MYBP. The results of phylogenetic study also revealed two subpopulations of R. rattus in Nepal, which were estimated to be separated approximately between 0.529 and 0.592 MYBP. Phylogenetic analysis showed two different subgroups (A and B); subgroup A contains the sequences of R. tanezumi only found in Nepal, and another subgroup B contains those from South and East Asian countries including Bangladesh, Laos, Vietnam, and South Korea. The genetic distance between these two subgroups was found higher than 0.02, which suggested being different lineages of R. tanezumi. The genetic distance between the haplotypes of R. nitidus abundant in Nepal, India, Laos, and Vietnam were ranged between 0.001 and 0.009 and were clustered together in a group at the phylogenetic tree, indicating close genetic relation among the different populations. The R. pyctoris have a single haplotype and have no other distinct genetic population so its phylogenetic relation studied with respect to haplotypes of other species. Genetically, it has close relation with R. tanezumi, which were diverge about 5.192-5.806 MYBP. This study provided the morphological and molecular dataset of murids found in Nepal. The molecular datasets generated in this study provided new records of M. m. bactrianus and R. tanezumi for Nepal. Though this study was carried out in selected areas of Nepal, the findings suggested that integrative studies of morphological and molecular analyses are required for correct identification and understanding the evolutionary phenomenon in murids. Further, extensive survey and collection of specimen from different localities across Nepal are required for determining the taxonomic status of murids and their phylogenetic relationship.

본 연구는 네팔의 Lumbini, Pokhara, Kathmandu 세 지역에서 발견되는 쥐과 동물에 대한 외부형태와 분자유전학적 분석을 통한 분류학적 연구를 수행하였다. 쥐과 동물에 대한 형태학적 동정을 위해서 모색과 발바닥, 꼬리, 귀, 외부생식기와 암컷의 유선 수 등 외부 형태에 대한 관찰과 측정치를 확인하였다. 형태학적 분석결과 전체 5 종(Bandicota bengalensis, Mus booduga, Niviventer fulvescens, Rattus pyctoris, Tatera indica)이 동정되었으나, 4 종(M. musculus, R. nitidus, R. rattus, R. tanezumi)은 동정할 수 없었다. R. rattus와 R. tanezumi 두 종의 형태학적 형질들을 비교하였으나 지속적으로 식별가능한 모색의 차이는 없었다. 또한 형태 계측 결과의 비교에서도 유의적인 차이는 없었다(Student t-test, n=52, df=50, p>0.05). 반면, 이들 두 종은 꼬리의 길이와 색깔에서 R. nitidus, R. pyctoris와 구별되었다. 이와 유사하게 M. musculus의 형태적 특성을 Lumbini 와 Pokhara에서 수집한 개체군 사이에서 비교하였다. 두 집단은 모색에 의해 구별되었으나, 외부형태 측정치에서는 유의적인 차이가 없었다(Student t-test, n=23, df=21, p>0.05). 분자유전학적 동정은 미토콘드리아 DNA (mtDNA) Cytrochrome B (CytB) 유전자 서열을 이용하여 수행하였고, 8 가지 분류군(B. bengalensis, M. booduga, M. musculus, N. fulvescens, R. nitidus, R. rattus, R. pyctoris, and R. tanezumi)은 종(species) 수준에서, 1 가지 분류군 (Mus sp.)은 속(genus)에서 성공적으로 동정되었다. 본 연구에서 결정된 분자 정보를 종내, 종간 변이를 구분하기 위하여 이용하였다. CytB haplotype을 모든 분류군에서 결정하였고, 쥐과 동물 114 개의 CytB 서열에서 총 41 가지의 독특한 haplotype들을 발견하였다. 연구결과에서 M. booduga (2), M. musculus (6), Mus sp. (2), R. nitidus (4), R. rattus (26) 등은 다수의 haplotype들을 나타내었으나 B. bengalensis, N. fulvescens, R. pyctoris, R. tanezumi 등은 하나의 halotype만을 나타내었다. 유전적 거리지수를 산출한 결과 동일종 내에서 R. rattus, M. musculus, R. nitidus, M. booduga의 거리지수는 각각 0.001-0.017, 0.001-0.016, 0.001-0.008, 0.001-004이었다. 동정된 쥐과 동물들에 대하여 산출된 유전적 거리지수 중에서 B. bengalensis와 M. musculus (0.278)가 최고치, R. rattus와 R. tanezumi (0.048)가 최소값을 보였다. CytB 서열을 이용하여 Mus와 Rattus 두 속에서 대한 계통유연관계 연구를 수행하였다. 속 내 종들 사이에서 산출된 유전적 거리지수를 바탕으로 계통수(neighbor joining tree, NJ tree)를 작성하였다. Mus 속의 세 종(M. musculus, M. booduga, Mus sp.)은 Mus 아속의 두 가지 종-집단로 구분되었고, M. musculus는 M. musculus species group, 나머지 두 분류군은 M. booduga species group에 위치하였다. M. musculus에 대한 계통 유연관계분석 결과는 mtDNA CytB haplotype들이 NJ tree 상에서 M. m. bactrianus와 M. m. castaneus 두 아종으로 대표되는 두 개의 clade로 구분되었고, 각각 Pokhara와 Lumbini에서 수집된 시료들임을 보여주었다. 이들 두 아종의 분화시간 추정 결과 약 0.68 MYBP(현재부터 약 100만 년 전, MYBP)에 분화된 것으로 추정되었다. 네팔과 인도에 풍부한 M. booduga의 두 집단에 대한 계통 유연관계 분석결과는 이들이 두 개의 다른 계통에서 발생한 것임을 보여주고 있다. 반면 Mus sp.는 종 수준까지 동정되지 않았으나, 계통유전학적 분석에서는 미얀마에서 기록된 M. nitidulus와 근연임을 나타내었다. 본 연구에서 동정된 Rattus 4 종에 대한 계통유전학적 유연관계를 분석하였다. 네팔에서 흔하게 발견되는 R. rattus는 계통수 상에서 파키스탄 개체들과 함께 하나의 그룹을 형성함으로써 매우 근연의 관계임을 보였다. 유전학적으로 이들 두 집단들은 인도 남부 집단과 근연관계를 보였으며, 약 2.097-2.344 MYBP에 분화된 것으로 추정되었다. 네팔 내에서도 두 가지 아집단들이 있었고, 약 0.529-0.592 MYBP에 분화된 것으로 추정되었다. R. tanezumi에 대한 계통 유연관계 분석에서 두 가지 subgroups(A, B)가 확인되었다; subgroup A는 네팔의 R. tanezumi 개체들만 위치하였고, subgroup B는 방글라데시, 라오스, 베트남, 대한민국 등 남아시아와 동아시아 국가들에서 보고된 서열들이 발견되었다. 두 subgroup 사이의 유전적 거리지수는 0.02보다 높은 수준을 보여, 두 subgroup은 R. tanezumi의 다른 계통인 것으로 보인다. 네팔, 인도, 라오스, 베트남에서 흔한 R. nitidus의 haplotype들 사이의 유전자 거리지수는 0.001-0.009이며 계통수 상에서 하나의 group형성하 여 집단들이 유전적으로 근연임을 나타내었다. R. pyctoris는 하나의 haplotype만을 나타내었고, 다른 종들의 haplotype 분석결과와는 달리, 서로 구분되지 않는 형태를 보였다. 유전학적으로는 R. tanezumi와 근연이었으며, 5.192-5.806 MYBP의 분화시간을 보였다. 본 연구결과들은 네팔에서 발견된 쥐과 동물의 형태적, 분자적 데이터들을 제공하였다. 연구를 통해 얻어진 분자 데이터 중에는 네팔에서 M. m. bactrianus and R. tanezumi가 서식한다는 새로운 기록을 제공하였다. 비록 네팔에서 선택된 몇몇 지역에 국한되어 연구되었으나, 연구결과들은 형태학적 연구와 분자적 연구들의 통합적인 연구 수행이 쥐과 동물의 진화적 현상을 이해하고 정확한 종 동정을 하는데 필요하다는 점을 제안하였다. 또한 쥐과 동물의 분류학적 위치와 계통유전학적 유연관계를 결정하기 위해서는 네팔 전체의 다른 지역들에서 시료의 수집과 확장된 조사들이 필요하다.