The effect of marine algal natural product, Diphlorethohydroxycarmalol on TNF-α or H2O2-induced inflammatory myopathy in in vitro and in vivo zebrafish model

Abstract

염증성 근육병증(inflammatory myopathy)은 주로 근육 조직에 염증세포가 침윤되어 근육의 만성 염증을 일으키며, 근육 조직 외에 폐, 심장, 관절 및 혈관 등에도 만성 염증을 일으키는 염증 질환이다(Baek et al., 2008). 급성 또는 만성 염증상태가 다른 병리학을 보이지만 골격근의 양과 생리물질이 분해되는 공통적인 특징을 보인다. 사이토카인은 면역세포 및 염증세포의 염증 반응을 유발하고 매개하는 주요한 분자(molecules)로 염증성 질환의 병인에 주요한 역할을 한다. 외부 환경물질들에 반응하여, 골격근은 근육을 리모델링하기 위한 다양한 신호 경로를 활성화시키며 근육 성능을 유지한다. 신호 경로 중 어떤 경로들은 골격근의 발달에 긍정적인 영향을 미치는 반면, 다른 경로들을 골격근의 발달을 저해한다. 근육 위 축이 발생하는 동안 이들의 신호 전달 경로가 활성화되고, 이는 근육의 발달을 돕는 단백질 합성의 저하를 촉매한다. 골격근 발달을 저해하는 신호 경로 중 대표적인 것은 E3 ubiquitin ligase 유전자인 muscle RING-finger protein-1(MuRF-1)과 muscle atrophy F-box(MAFbx/Atrogin-1)로 이들이 극도로 발현되게 된다. 따라서, 이들의 발현을 조절하는 세포 내 메커니즘을 찾는 것이 중요하다. 이 외 nuclear factor kappa B (NF-κB) 신호 경로 또한 골격근 위축에 관여한다. C2C12 골격근 세포에서 NF-κB가 염증성 사이토카인 tumor necrosis factor alpha(TNF-α)에 조절된다는 것이 밝혀졌다(Cai et al., 2004; Mourkioti et al., 2006; Guttridge et al., 2000; Li et al., 2005). TNF-α는 종양괴사인자로 급성 염증 반응 사이토카인이다. TNF-α는 체내 발열원으로써 열이 나게 유도하거나, 세포 자살을 유도하거나, interleukin-1(IL-1)과 IL-6 사이토카인의 생산을 통해 패혈증을 유발하거나, 악액질을 유도하거나, 감염 을 유발하며 종양 생성과 바이러스 복제를 억제하는 능력을 갖는다. TNF-α의 비정상적인 조절은 알츠하이머 병, 암, 우울증, 그리고 염증성질환 등의 질병에서 나타난다(Swardfager et al., 2010; Locksley et al., 2001; Dowlati et al., 2010). 이 때문에 항염증 치료제로 TNF-α 억제제가 개발되고 사용된다. 이들은 비스테로이드성 소염진통제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs) 및 스테로이드 대체제로 사용되고 있으며, 류마티스 관절염, 건성성 관절염 및 척추염 치료제에 특화되어 있다. TNF-α 억제제 치료제는 주사제로 사용되고 있는데, 이 때문에 주사 부위의 발열, 홍반, 두드러기, 경화, 통증, 가려움, 자극 및 지각(감각) 이상을 나타내며 간혹적으로 (결핵)바이러스 감염, 간기능부전, 백반증, 림프종이 보고되면서 부작용의 문제점이 발생하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 해양생물 중 다양한 이차대사산물을 함유하고 있으며, 항산화, 항염, 항암, 항당뇨, 항고혈압, 및 항비만 등의 여러 가지 생리활성이 보고된(Kim et al., 2016; Sanjeewa et al., 2017; Lee et al., 2015; Kim et al., 2016; Wijesinghe et al., 2011; Kang et al., 2016) 갈조류로부터 얻을 수 있는 유용성분으로부터 천연 TNF-α 억제제를 찾고자 하였다. 마우스 유래 C2C12 골격 근세포와 Zebrafish (Danio rerio) 동물 모델을 이용하여 염증성 근육손상 모델을 정립하고, 6가지의 갈조류로부터 TNF-α 저해제 역할을 하는 유용성분을 확인하였다. 본 연구에서 사용된 6가지의 갈조류는 패(Ishige okamurae, IO), 넓패(Ishige foliacea, IF), 감태(Ecklonia cava, EC), 톳(Hizikia fusiforeme, HF), 바위수염(Myelophcus caespitosus, MC), 괭생이모자반(Sagarssum horneri, SH)으로 에탄올 주정 추출물로 마우스 유래 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 항염증 효능과 마우스 유래 골격근 세포인 C2C12 세포에서 근세포증식 효능을 탐색하였다. 6가지의 갈조류 추출물은 모두 LPS로 염증 자극된 RAW 264.7 세포에서 분비되는 nitric oxide(NO)의 양을 현저히 감소시켰으며, 패(IO)와 넓패(IF) 추출물이 C2C12 근세포 증식에 효능이 있는 것을 확인하였다. 또한, 6가지의 갈조류 추출물로부터 얻을 수 있는 유용성분이 근육 염증을 일으키는 TNF-α의 억제제 역할을 할 수 있는지 확인하기 위하여 in silico molecular docking 분석을 통하여 TNF-α와의 결합능력을 확인하였다. 그 결과, 패(IO) 유래 Diphlorethohydroxycarmalol(DPHC), 감태(EC) 유래 Dieckol(DK), 톳(HF) 유래 Saringosterol A(SA), 바위수염(MC) 유래 Gadoleic acid (GA), 괭생이모자반(SH) 유래 Sargachromanol E(SC-E)의 총 5가지 유용성분이 TNF-α와 안정적으 로 결합하는 것을 확인하였다. 그러나, 이 중 DPHC가 다른 4가지의 유용성분보다 가장 높은 결합력(-53.73 kcal/mol of Binding energy)으로 TNF-α와 결합하는 것을 확인하였다. 이를 통하여, 항염증 및 근세포증식 효능을 나타내며 TNF-α 저해제 역할이 가능할 것으로 예상되는 DPHC를 염증성 근육손상의 잠재적 보호 물질로 예상되어 C2C12 근세포와 zebrafish 동물모델의 근육에 염증을 유도하여 DPHC의 보호능력을 확인하였다. 근육 염증을 유도하는 물질로는 직접적인 영향을 미치는 TNF-α와 염증성 사이토카인을 분비하게 하는 산화적 스트레스 유발물질은 H2O2 두 가지를 이용하였 다. TNF-α와 H2O2는 C2C12 근세포에 처리되면서 근육 다발로의 형성이 무너지며 손상된 근육 세포 내 대표적인 인자인 MuRF-1과 MAFbx/Atrogin-1의 발현이 강하게 발현하는 것을 확인하였다. 반면, 후보물질인 DPHC를 근육 다발로의 분화 과정 중에 처리하였을 때 TNF-α와 H2O2에 의한 근육 손상이 보호되는 것을 근육 세포의 생존율, 크기, 세포에서 분비되는 NO 분비와 TNF-α, IL-1β, 및 IL-6 염증성 사이토카인의 발현이 감소되며 항산화 효소가 활성화하는 것을 확인하였다. 또한, TNF-α가 TNF-α receptor에 결합하여 근육 손상을 유발하는 하위기전인 세포질 내 MAPKs(p-JNK 및 p-p38)과 p-IκB-α 및 p-NF-κB의 단백질 발현과 이 신호전달에 의한 핵 내 MuRF-1과 MAFbx/Atrogin-1의 발현이 DPHC에 의해 크게 감소하는 것을 확인하였다. C2C12 골격근 세포에서 TNF-α와 H2O2에 의한 근육 손상이 DPHC 가 보호함에 따라 DPHC가 염증성 근육 손상의 천연 보호제 및 TNF-α 억제제로 사용될 수 있을 것을 기대하여 유전자정보 및 조직기관이 인간과 유사한 척추동물로 분자생물학적 연구 동물 모델로 최근 각광받고 있는 제브라피쉬(Zebrafish)를 이용하여 염증성 근육 손상 모델을 만들고 이에 DPHC의 보호 효능을 확인하였다. 제브라피쉬 근육에 TNF-α와 H2O2를 주입하여 근 손상을 유도하였다. 그 결과, TNF-α와 H2O2가 제브라피쉬 근육 조직을 분해하는 것을 확인하였고, 단백질 발현분석을 통해 MuRF-1과 MAFbx/Atrogin-1의 발현이 강하게 발현하는 것을 확인하였다. 반면, DPHC를 TNF-α와 H2O2의 주입 전과 동시에 근육에 주입한 후 근육 조직을 얻어 조직 세포 내 MAPKs(p-JNK 및 p-p38)과 p-IκB-α 및 p-NF-κB의 단백질 발현과 MAFbx/Atrogin-1의 발현을 확인하였을 때, TNF-α와 H2O2만을 주입한 제브라피쉬의 근육 조직에서 강하게 발현한 위의 단백질이 크게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 조직 염색을 통하여 근육의 모양을 확인한 결과, TNF-α와 H2O2에 의해 근육의 모양이 무너지거나 세포가 깨진 모습이 DPHC를 주입한 제브라 피쉬의 근육의 모양이 정상 제브라피쉬와 유사한 것을 확인하였다. 이와 더불어 근육의 양과 지구력이 상관관계를 지니는 점을 활용하여 물의 흐름과 경사도에 일정 시간 동안 놓였을 때의 지구력을 확인하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 정상 제브라피쉬에 비해 TNF-α와 H2O2를 주입한 제브라피쉬가 물의 흐름과 경사도에 버티지 못하고 쉽게 낙하하는 것을 확인하였으며, 반면, DPHC의 고농도를 주입한 제브라피쉬의 경우 TNF-α와 H2O2를 주입한 제브라피쉬보다 물의 흐름과 경사도에 유의성 있게 버티는 것을 확인하였다. 위의 결과들을 종합하여 볼 때, 갈조류 중 패(IO)로부터 얻을 수 있는 유용성분인 DPHC가 TNF-α와 H2O2에 의한 염증성 근육 손상을 MAPKs과 NF-κB 신호 전달 경로를 억제하며 보호하는 것을 C2C12 근세포와 제브라피쉬 근육 조직에서 확인하였다. 이를 통해 DPHC가 TNF-α 저해제로 사용되는 주사제 대신에 근육의 염증을 감소시킬 수 있는 기능성식품으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.