인간 림프아세포에서 Di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), Dibutyl phthalate (DBP)의 돌연변이성 및 세포사멸 기전 연구

Abstract

본 연구는 인간 림프아성 TK6 세포에서 DEHP, DBP 및 이에 대한 대사산물 MEHP, 2-EHA 그리고 DBP의 돌연변이성 및 세포사멸 기전을 조사하기 위해 수행되었다. TK6 세포에 DEHP, DBP는 집접법과 rat S9을 첨가한 대사활성법 으로 노출하여 측정하였으며, 대사활성법은 hoese serum을 제외한 배지를 사용 하여 6시간 동안 노출시켰고, MEHP, 2-EHA 및 MBP 또한 hoese serum을 제 외한 배지에서 1시간 동안 노출시켰다. 세포 생존율이 30 % 이상인 농도로 HP RT와 TK1 유전자에서 6-thioguanine와 trifluorothymidine 내성 돌연변이체 를 평가하였다. DEHP, DBP 및 이에 대한 대사산물은 세포 사망률, 돌연변이 빈 도 그리고 NO• 생성량이 농도 의존적인 증가를 나타내었으나, 상당한 효능의 변화를 나타내었다. MEHP, 2-EHA 및 MBP의 세포 독성 및 돌연변이 빈도는 parents compound인 DEHP와 DBP 보다 높게 나타났다. 이는 HP RT 및 TK1 유전자에서 DEHP, DBP 및 이에 대한 대사산물의 변이원성을 나타내고, 생체 내에서 영향을 끼치는 메카니즘 설명에 기여할 수 있다. MEHP는 DEHP의 대사물질로 독성에 대한 메카니즘이 불분명하다. 본 연구는 TK6 세포에서 MEHP에 의해 apoptosis가 유도되는 동안에 NO•, ROS 및 IAP family의 역할을 조사하였다. 이에 대한 결과로 MEHP에 노출된 TK6 세포에서 강한 apoptosis가 유도되었다. MEHP는 NOS의 발현을 상향 조절하고, NO• 및 ROS 생성을 증가시키고, apoptosis 억제 신호 IAP를 약화시켜 apoptosis 과정을 촉진시킨다. 전체적으로, 이에 대한 결과는 MEHP에 의해 유도된 apoptosis가 내 인성 NO•, ROS의 조절 및 IAP family 유전자 발현과 관련이 있음을 나타낸다.

This present study was undertaken to examine the molecular mechanisms of mutagenesis and apoptosis of Di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP), dibutyl phthalate (DBP) and its metabolites mono (2-ethylhexyl) phthalate (MEHP), 2-ethylhexanoic acid (2-EHA) and monobutyl phthalate (MBP) in human lymphoblastoid TK6 cells. TK6 cells were exposed to either rat S9 activated DEHP, DBP for 6 h or MEHP, 2-EHA and MBP for 1 h in serum-free medium. Cell survival determined by trypan blue exclusion, and 6-thioguanine and trifluorothymidine-resistant mutants at the hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase ( HPRT ) and thymidine kinase ( TK1 ) genes were assessed with doses of which relative survival is 30 % or more. DEHP, DBP and its metabolites tested showed dose-dependent increases in cell killing and mutant fraction with increasing nitric oxide (NO•) production but exhibited considerable variation in potency. MEHP, 2-EHA and MBP were considerably more cytotoxic and mutagenic than the corresponding parent compound DEHP and DBP. These findings indicate the mutagenicity of DEHP, DBP and its metabolite at the HPRT and TK1 loci and contribute to the elucidation of mechanisms through which DEHP, DBP and its metabolite may exert its effects in vivo. MEHP, one of the metabolites of DEHP. However, the detailed mechanisms of toxicity remain unclear. The present study investigated the role of NO• and reactive oxygen species (ROS), and inhibitors of apoptosis (IAPs) during apoptosis induced by MEHP in TK6 cells. Here we show MEHP induced strong apoptotic response in TK6 cells. MEHP up-regulated the expression of nitric oxide synthase (NOS), elevated NO• and ROS production and weakening the anti-apoptotic signals IAPs thus facilitating the process of apoptosis. Collectively, our results indicate that MEHP-induced apoptosis was related with modulation of endogenous NO• and ROS, and IAP family gene expression.