Improvement of glucose homeostasis by Ishophloroglucin A and Diphlorethohydroxycarmalol from Ishige okamurae in diabetic zebrafish model

Abstract

항상성은 외부 조건의 변화에 대하여 인체 내부 기작이 작동하여 물질대사가 진 행될 수 있도록 정해진 환경을 유지하는 것으로, 이러한 기작들은 세포, 조직, 기관, 유기체 전체 수준에서 일어난다. 우리 몸은 음식물을 섭취해서 영양소를 공급받고 이를 체내에서 소화, 흡수 과정을 거쳐 온몸의 세포에 전달하여 에너지 원으로 포도당이 사용된다. 사람의 혈액에는 일정한 양의 포도당이 존재하며, 체 내에서 포도당이 정상적으로 이용되지 않을 경우 항상성이 깨지고 결과적으로 체 내 혈당이 정상보다 높은 상태로 지속되며 이를 당뇨병이라고 한다. 포도당 항상 성은 혈당을 유지시키기 위해 인슐린과 글루카곤의 균형을 통해 유지된다. 이는 주로 뇌, 췌장, 간, 또한 근육 조직으로부터 방출되는 다양한 호르몬과 신경 펩 티드의 네트워크에 의해 수행된다. 특히, 본 연구에서는 포도당 항상성을 위해 포도당이 근육으로 어떻게 흡수되고 어떻게 조절되는지에 대하여 알아보고자 한 다. 이전 연구에서 세포내 칼슘 레벨이 증가하면 membrane으로 이동하는 당 수송 체 중 하나인 Glucose transporter 4 (Glut4)가 memebrane으로 이동하게 되고 이 를 포도당이 근육으로 흡수된다고 보고되었다. 또한, 건강한 근육에서는 외부 자 극이 주어졌을 때 세포내 칼슘 레벨이 증가하는 반면, 당뇨병에서의 근육에서는 외부 자극이 주어졌을 때 세포내 칼슘 레벨이 증가하나 그 양이 건강한 근육에 비해 적다는 것이 보고되었다. 이는, 실제로 근육 세포내 칼슘이 혈당조절에 관 여함을 보여준다. 해조류 중 패는 이전연구에서 당뇨모델인 db/db 마우스 및 hyperglycemic zebrafish 모델에서 혈당 조절을 통해 항당뇨 효능이 입증되었다. 더불어, 패에 서 분리된 물질인 Ishophloroglucin A (IPA) 와 Diphlorethohydroxycarmalol (DPHC) 는 혈당조절을 위한 기능성소재로서 잠재적 가치가 있다고 보고되었다. 그러나, 패 추출물 및 유래 물질인 IPA 와 DPHC가 근육에서의 포도당 항상성 유 지 및 에너지 대사에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 혈당조절을 위해 근육세포 및 zebrafish 모델에서 패 추출물, IPA, 그리고 DPHC 처리에 따른 세포내 칼슘 변화, 포도당 항상성, 및 에너지 대사에 대한 작용을 확인하고자 하였다. 먼저, 근육세포에서 인슐린없이 패 추출물 처리에 의해 glucose uptake가 증가하 는 것을 통해 hyperglycemic zebrafish 모델에서 평가한 결과, 혈당조절능이 있 음을 확인하였다. 패 추출물에 의해 혈당 조절이 됨에 따라, 패 추출물이 어떻게 근육 내로 포도당 흡수를 자극 시킬 수 있는지에 대하여 살펴보았다. 이전 연구 에서는 외부의 자극에 의하여 세포내 칼슘이 증가하고 이를 통해 Glut4가 translocation이 되면서 포도당이 근육으로 흡수된다고 보고되었다. 이를 통해 패 추출물을 근육 세포에 처리하였을 때 세포내 칼슘 레벨 변화에 대하여 확인하 였다. 근육 세포내 칼슘은 패 추출물 처리에 의해 현저하게 증가하지만 칼슘 chelator 인 BAPTA-AM을 처리하였을 때는 세포내 칼슘 변화가 없음을 확인하였다. 이러한 세포내 칼슘 변화가 어떤 기전을 통해 자극이 되는지 살펴보았다. 이전 연구에 따르면, 세포내 칼슘 증가 경로는 칼슘 channel을 통한 칼슘 influx와 근소포체 안에 있는 칼슘이 세포질 내로 방출되는 경로가 있다고 보고되었다. 패 추출물 처리에 따른 세포내 칼슘 증가가 어떤 경로와 관련 있는지 확인하고자 세포 외 칼슘의 유무에 따른 세포내 칼슘 레벨을 측정하였다. 그 결과 세포 외 칼슘의 유 무에 관계없이 패 추출물 처리에 따른 세포내 칼슘 레벨 변화가 없음을 확인함으 로써 패 추출물에 의한 세포내 칼슘 레벨 변화는 근소포체에서 세포 내로 칼슘 방출과 관련이 있음을 시사할 수 있다. 더불어, 패 유래 물질인 IPA와 DPHC 처리 에 따른 세포내 칼슘 레벨 변화를 확인한 결과 근소포체에서 세포 내로 칼슘 방 출함으로써 세포내 칼슘을 증가시키는 것을 확인하였다. 그리고 IPA 와 DPHC가 glucose uptake를 증가시켜 hyperglycemic zebrafish 모델 에서 혈당 조절이 되는 것을 확인하였다. 이를 통해 zebrafish 모델에서 세포내 칼슘 변화에도 영향을 주는지 확인하였고 그 결과, IPA와 DPHC를 처리한 zebrafish 에서 세포내 칼슘 레벨이 증가하였으나, BAPTA-AM을 처리한 군에서는 변화가 없음을 확인하였다. 이는 패 유래 물질인 IPA와 DPHC가 zebrafish에서 세 포내 칼슘 레벨을 증가시키며, zebrafish가 세포 내 칼슘 레벨 변화를 확인하는 데 있어 동물모델로서의 적용가능함을 시사할 수 있다. 더 나아가, IPA와 DPHC가 세포내 칼슘을 증가시킴으로써 혈당조절에 도움을 줄 수 있는지 확인하기 위해 hyperglycemic zebrafish 모델 에서 IPA와 DPHC 그리고 BAPTA-AM을 주입시킨 뒤, 혈당을 측정하였다. 그 결과, IPA와 DPHC만을 주입한 군에서는 혈당조절이 가능하나, BAPTA-AM과 IPA 또는 DPHC를 주입한 군에서는 혈 당조절이 되지 않았다. 이를 통해 세포 내 칼슘 증가에 따라 혈당조절이 가능하 다는 것을 시사할 수 있다. 세포내 칼슘 레벨 변화에 따라 혈당 조절하는데 있어 작용하는 관련 단백질 인자의 변화를 확인하였다. 관련 단백질인 AMPK와 Glut4가 zebrafish 근육 조직에서 IPA와 DPHC에 의해 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통 해 IPA 와 DPHC는 근소포체에 있는 칼슘을 세포 내로 방출시켜 세포내 칼슘 레벨 을 증가시키고 이후, AMPK와 Glut4를 자극하게 되어 세포 외의 포도당을 세포 내 로 흡수시키는 것을 확인하였다. 결과적으로 IPA와 DPHC에 의해 혈당조절이 가능 함을 확인하였다. 더 나아가 포도당 항상성에 문제가 생겼을 때, glucose intolerance 에서도 어떠 한 영향을 주는지 확인하기 위해 4% high cholesterol diet (HCD)를 한 zebrafish 모델을 사용하였다. 우선, HCD의 식이 기간에 따른 혈당 변화 및 Glut4 발현을 통해 당뇨 연구를 위한 모델로서의 적용 가능성을 확인하였다. 5주동안 HCD를 식 이하고, 매주마다 IPGTT를 통해 혈당 변화를 관찰하였다. 그 결과, 식이 기간이 증가함에 따라 non cholesterol diet (NCD)군에 비해 혈당 조절이 되지 않으며, 특히, 공복 및 식후 혈당이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Glut4 발현을 통해 당수송체에도 기능장애가 발생하는 것을 확인하였다. 따라서, 당뇨연구를 위한 모델로서 HCD zebrafish 모델의 적용 가능성을 시사할 수 있다. 패 추출물, IPA, 그리고 DPHC가 포도당 항상성을 조절할 수 있는지 확인하기 위 해 3주동안 HCD를 식이하고 2주동안 HCD에 각각의 시료를 혼합하여 식이하였다. 5주 이후, IPGTT를 통해 혈당 변화를 관찰하였으며, 근육 조직에서 당수송체인 Glut4 발현 변화를 관찰하였다. 그 결과, HCD만을 식이한 군에서는 혈당 조절이 되지 않으며, 공복, 식후 혈당 및 Glut4의 발현이 NCD 군에 비해 감소하는 것을 확인하였다. 감소한 공복, 식후 혈당 및 Glut4의 발현이 패 추출물, IPA, 그리고 DPHC를 식이한 군에서 개선되는 것을 확인하였다. 이를 통해, 패 추출물 그리고 유래 물질인 IPA와 DPHC가 HCD에 의해 손상된 glucose tolerance 를 개선시키는 것을 확인하였다. 이를 통해 패 추출물과 유래 물질인 IPA와 DPHC의 식이가 포도 당 항상성을 유지시키는데 도움을 준다는 것을 시사할 수 있다. 이전 연구에 따르면, 근육 세포내 칼슘 레벨이 증가하였을 때, 근수축이 발생하 게 된다. 이를 통해, IPA와 DPHC에 의해 증가된 근육 세포내 칼슘 레벨이 결과적 으로 근수축에 영향을 주는지 대해 확인하고자 하였다. Troponin C는 칼슘이 결 합하는 부위이며, Troponin I 는 근육이 이완되었을 때 교차 다리를 억제하는 부 위이다. 우선, HCD의 식이 기간에 따른 근수축 기능을 면역형광 및 조직학적 변 화를 통해 확인한 결과, 식이 기간에 따라서 Troponin C의 발현은 감소하고 Troponin I의 발현은 증가하였다. 이를 통해, HCD 식이에 따라 근수축 기능 장애 를 유도 시킬 수 있음을 확인하였다. HCD 식이에 의해 유도된 근수축 기능 장애를 IPA와 DPHC가 개선시킬 수 있는지에 대한 효능평가를 면역형광 및 조직학적 변화를 통해 확인하였다. IPA와 DPHC를 식이한 군에서 HCD 군보다 Troponin C 의 발현은 증가하고 Troponin I의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 게다가, Metformin을 식이한 군보다 IPA와 DPHC 식 이를 한 군에서 근수축 기능 장애가 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 근수축 관련 인자인 CaMKⅡ의 발현을 확인하였으며 그 결과 IPA와 DPHC를 식이한 군에서 발현이 증가하였다. 이를 통해 HCD 식이에 의한 근수축 기능 장애 를 IPA와 DPHC 식이에 의해 개선되는 것을 확인하였다. 더 나아가, IPA와 DPHC가 근육 세포내 칼슘 증가로 인해 발생된 근수축을 통해 세포내로 흡수된 포도당이 어떻게 에너지를 발생하게 되는지 확인하였다. Zebrafish 근육 조직에서 세포내로 흡수된 포도당은 해당과정을 통해 ATP를 발생 하는 것을 확인하였다. 이렇게 발생된 ATP는 다시 근수축을 유도하게 된다. IPA 와 DPHC의 처리에 따른 에너지 소비를 확인한 결과 처리 1시간 뒤에 급격하게 증 가하는 것을 확인하였다. 이 모든 결과를 종합해 볼 때, 패 추출물 및 유래 물질인 IPA 와 DPHC가 근육 세 포내 칼슘 레벨을 증가시켜 세포외 포도당이 세포내로 흡수되어 결과적으로 혈당 조절을 하는 것을 확인하였다. 포도당 항상성 연구를 위해 HCD zebrafish 모델을 구축하였으며, 이 모델을 이용하여 패 추출물, IPA, 그리고 DPHC의 glucose intolerance를 개선시키는 것을 확인하였다. 더 나아가, IPA와 DPHC에 의한 근수 축을 통해 발생되는 변화 및 포도당을 이용하여 발생되는 에너지 대사를 조절하 는 것을 확인하였다. 이를 통해, 패 추출물, IPA, 그리고 DPHC는 항당뇨 소재로 서 잠재적인 기능성 식품 및 천연의학 소재로서 충분한 가능성이 있으며, HCD zebrafish 모델이 당뇨를 비롯하여 다양한 대사성질환 연구에 있어 널리 이용 되 어질 것이라 사료되어진다.