반달가슴곰(Ursus thibetanus) 인공증식 기술 개발에 관한 연구

Abstract

본 연구는 암컷 반달가슴곰의 뇨 중 성호르몬 분석과 다양한 생물학적 지표 관찰이 반달가슴곰 종의 번식상태와 인공수정 적기의 파악을 위한 유용성 여부를 조사하고, 수집된 신선 정액을 가장 효율적으로 주입할 수 있는 자궁 내 인공수정 기법을 확립하고자 수행하였다. 이를 위하여, 뇨 중 estrogen 및 progesterone의 대사물질(metabolites) 농도에 기초한 번식기 동안의 암컷 반달가슴곰(Ursus thibetanus)의 발정 패턴 및 배란 적기 파악을 위한 조사를 실시하였다. 아울러 인공수정 적기를 파악할 수 있는 난포와 황체의 초음파 상, 질 상피세포 상, 질 점막 전기저항, 그리고 외음부의 형태 등의 다양한 생물학적 지표들의 특성을 조사하였다. 최종적으로, 초음파 가이드 하에 요관경 장비를 이용한 인공수정 기법을 확립하였다. 반달가슴곰의 번식기간인 5월부터 8월까지 공시된 4마리의 암컷 곰에서 뇨 중 에스트로겐 대사물질(17β-estradiol vs. estrone-3-glucuronide)과 프로게스테론 대사물질(progesterone vs. pregnandiol-3-glucuronide)의 농도는 각각 월별로 상호 유사한 변화 패턴이 확인되었다. 그러나 각각의 호르몬이 상승 또는 하강하는 시기와 성호르몬 대사물 농도 정점(peak)의 수치, 횟수, 그리고 정점 간의 간격은 개체마다 변이가 컸으며, 일정한 패턴을 나타내지 않았다. 12월에 초음파 검사를 통해 임신이 확인된 암컷 곰(n = 1)의 경우, 5월부터 7월까지 뇨 중 progesterone (P4)의 농도가 서서히 상승하였다가 인공수정 이후, 8월에 급격히 P4의 평균 농도가 상승하였고, 특히 6월과 8월에 통계적으로 의미있는 상승을 보였다(p < 0.05). 반면, 임신하지 않은 곰들은 같은 기간 동안에 임신한 곰에서 보인 P4의 변화 양상은 관찰되지 않았다. 각각의 성호르몬 값 간에는 임신한 암컷 곰에서의 E2와 P4 사이를 제외하고 모두 양의 상관관계를 나타내었다. 번식기 중의 우성난포는 개체에 따라 7.3-19.6 mm 크기의 1-4개까지 형성되었으며, 6 mm 이상의 우성난포가 최대 직경에 도달할 때까지 약 2주 이상의 기간이 소요되었다. 또한 배란 이후에 확인된 황체의 크기는 개체에 따라 7.0-10.6 mm로 다양하였다. 질 상피세포 검사 결과, 발정 징후가 감지되는 시기에 형태학적으로 표재세포(Superficial cell)의 출현 비율이 증가할수록 호산성세포(Acidophilic cell, red color)와 각질화세포(Keratinized cell, orange color)가 함께 증가하였던 반면, 호염성세포(Basophilic cell, blue color)의 출현은 감소하였다. 발정기 동안의 표재세포의 출현 비율이 최대(82.3 ± 7.8%)일 때 질 점막 전기저항 수치는 평균 360 ± 56.9 Ω로 증가하였다. 외음부의 종창은 질 상피세포 검사 및 행동학적 관찰과 더불어 암컷의 발정 상태를 확인할 수 있는 또 하나의 지표이며, 본 연구를 통해 외음부의 종창이 증가함에 따라 발적, 점액 분비, 표재세포 출현 비율, 그리고 질 점막 전기저항 수치가 함께 증가하는 양상을 확인할 수 있었다. 결과적으로 새끼 출산에 성공한 암컷 곰들은 인공수정 당일 6.3-10 mm의 우성난포가 관찰되었고, 1개체를 제외한 나머지 암컷 곰의 표재세포의 비율은 70 % 이상 출현하였으며, 질 점막 전기저항 수치는 340-400 Ω, 그리고 외음부의 크기는 검사 기간 동안에 최대로 증가하였음을 확인하였다. 또한 뇨 성호르몬 검사를 동반한 개체는 인공수정일 전일과 당일 에스트라디올의 농도에 차이(전일: 8.26 vs. 당일: 1.45 ng/㎎ Cr)가 관찰되었다. 수집된 신선 정액은 선행 연구에서와 같이 정자 농도, 정자 수, 생존율, 운동성, 정자 형태 등에서 매우 우수한 상태인 것으로 분석되었고, 초음파 가이드 하에 요관경을 통해 자궁경관을 경유하여 자궁 내로 인공수정을 실시하였다. 외음부로부터 자궁 경관까지의 길이는 평균 14.2 ± 1.5 cm(n = 23)이었다. 12월 말경에 실시한 초음파 임신진단 결과, 총 4마리의 임신한 암컷 곰으로부터 골격과 장기가 확인되는 크기가 서로 다른 총 7마리의 태아를 확인하였다. 결과적으로 7마리의 새끼 모두 출산하는데 성공하였으며, 친자 확인 검사를 통해 1마리의 새끼 곰을 제외한 6마리의 새끼 곰들이 인공수정에 의해 태어난 것으로 최종 확인되었다. 이를 근거로 산정한 총 임신기간은 수컷 곰의 정액을 주입한 인공수정 일자로부터 새끼 출산까지 199.3 ± 13.4일(범위: 184-216일, n = 4)이었다. 본 연구의 결과는 반달가슴곰의 복원사업 과정에서 인공수정을 통해 새끼 출산에 성공한 세계 최초이자 유일한 사례로서, 본 연구를 통해 도출된 결과들은 추후 반달가슴곰을 대상으로 하는 후속적인 번식생리 연구와 인공증식 기술의 개선을 위한 초석으로 활용될 것으로 기대된다. 또한 종복원사업 추진 과정에서 문제점으로 지적되었던 사항 즉, 해외로부터의 도입에 따른 이슈와 국내의 자연 복원 개체군의 유전적 다양성 문제들의 해소에 도움을 줄 수 있을 것으로 판단되며, 더 나아가 건강한 반달가슴곰 개체군 형성과 성공적인 복원사업 추진에 크게 기여를 할 것으로 사료된다.

This study is to investigate the estrus pattern and ovulation time in female Asiatic black bear (Ursus thibetanus) during the breeding period based on the concentration of estrogen and progesterone metabolites in urine, and to investigate the characteristics of various biological indicators that can estimate the best timing for artificial insemination. In addition, it is a report on the establishment of artificial insemination technique using the ureteroscope under ultrasound guidance. The purpose of this study is to investigate whether analysis of sex hormones in urine and observation of various biological indicators is useful for determining the breeding status and the time for artificial insemination in Asiatic black bears, to establish an effective artificial insemination technique in Asiatic black bears. During the breeding period from May to August, the concentrations of 17β -estradiol and estrone-3-glucuronide in urine from 4 female bears showed similar patterns of change over time, and the concentrations of progesterone and pregnandiol-3-glucuronide also similarly changed over time. However, there were differences among the bears in increasing or decreasing period, the highest concentration, the number of peak days and the interval between peak days of each sex hormone and its metabolite, and did not show a constant pattern. In a pregnant female bear that was confirmed by ultrasound examination in December, the concentration of progesterone in urine gradually increased from May to July, and increased rapidly after artificial insemination in August. While, non-pregnant bears did not show this rapid increasing of progesterone in August. During the breeding period, from 1 to 4 dominant follicles were formed in size of 7.3 - 19.6 mm, and it took about 2 weeks or more for the dominant follicle over 6 mm to reach the maximum diameter. In addition, the size of the corpus luteum varied from 7.0 to 10.6 mm. In the vaginal cytology, superficial epithelial cells increased and those colors were mostly red or orange when estrus signs were shown. In addition, when the appearance rate of superficial cells was at maximum (82.3 ± 7.8%), the electrical resistance value of vaginal mucus was also at maximum (360 ± 56.9 Ω). When the swelling of the vulva, which is one of the indicators for female's estrus state, increased, the level of redness in the vulva, mucus secretion, the rate of superficial cell appearance and the electrical resistance of vaginal mucus also increased. As a result, it was confirmed that dominant follicles of 6.3 – 10 mm, the appearance of over 70% of superficial epithelial cells, the vaginal mucus electrical resistance of 340 – 400 Ω and maximum size of vulva on the day of artificial insemination were appropriate conditions for female bears in giving birth the cubs. In addition, the concentration of 17β-estradiol in a female urine was 8.26 ng/㎎ Cr and 1.45 ng/㎎ Cr on the day before and the day of artificial insemination respectively. The quality of collected fresh semen was excellent in sperm concentration, sperm count, survival rate, motility, and sperm morphology, and the semen was put in the uterus through the cervix using the ureteroscope under the ultrasound guide. The average length from the vulva to the cervix was 14.2 ± 1.5 cm. 7 fetuses were identified from 4 pregnant female bears by ultrasound pregnancy test conducted at the end of December. All fetuses were born in mid- and late January and it was confirmed that 6 cubs were born through the artificial insemination except for one cub (it was originated from natural mating) by genetic paternity tests. Thus, the total gestation period from the date of artificial insemination to the birth of cubs was 199.3 ± 13.4 days (range, 184 - 216 days). This study is the first report of success in giving birth through artificial insemination in the Asiatic black bear, and it would be very useful data to establish artificial breeding technique in this species. Furthermore, the methodology and results in this study would be greatly helpful for the restoration of the Asiatic black bear.