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Immune-enhancing activities of Combination of the Sargassum horneri polysaccharides and Lactobacillus plantarum in macrophages and zebrafish model

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Abstract
Sargassum horneri (S.horneri) is brown algae that are invasive into the coast of South Korea, particularly Jeju island from the east coast of China which causes serious economic losses. Current researches on polysaccharides from S.horneri (SHC.Ps) have many bioactivities such as anti-inflammation, anti-allergic, immunomodulating activities. On the other hand, Probiotics, in particular, Lactobacillus Plantarum (LAB) have shown for immune-enhancing activities. Therefore, in this study, we evaluated the immune-enhancing activities potential of the combination of SHC.Ps and LAB in LPS- stimulated murine macrophages and zebrafish. we investigated the immune-enhancing activity of the combination of SHC.Ps and LAB, using murine macrophages and zebrafish model. In vitro experiment, the phagocytic activities against IgG-opsonized FITC particles were measured using a phagocytosis assay kit.
Also, we identified that the combination of SHC.Ps and LAB was increasing pro-inflammatory cytokines such as IL-6, tumor necrosis factor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), and immune regulator's nitric oxide (NO) which is stimulated its own phagocytosis or induces innate immunity such as natural killer cells and dendritic cells while immunizing antigens introduced from outside T cells.
The monocytes were known to occur when you are recovering from an acute infection were increased in kidney marrow. We confirmed the combination of SHC.Ps and LAB can be revealed the increase of lymphocytes and myelomonocytes by flow cytometric analysis of cells from adult whole kidney marrow in zebrafish models. Also, we observed that goblet cells involved in the formation of the intestinal mucosa, and immunity of epithelial cells was observed and were increasing by a combination of SHC.Ps and LAB similar to the control group. These results indicate that the combination of SHC.Ps and LAB exerted the enhanced immunostimulatory activity and contained more nutritional components, and it may be applied as an agent for immune-boosting therapy.
면역반응은 우리 몸을 보호하기 위한 자기방어 기작으로서 외부 인자로부터 유입된 다양한 감염원을 제거 또는 무력화하는 과정을 포함하고 항상성을 유지하기위해 단핵구 (monocyte), 호중구 (neutrophile) 및 포식세포 (phagocyte) 등과 같은 다양한 면역 세포들 간의 상호작용에 의하여 그 체계가 유지된다. 체내 면역반응은 크게 선천적 면역반응과 후천성 면역반응 두가지로 구분되며, 각기 면역작용을 나타내는 담당 면역세포가 다른 특징을 가지고 있다. 선천적 면역반응을매개하는 세포 중 대식세포 (macrophage)는 외부 항원을 포식하고, 면역 조절인자인 nitric oxide (NO)와 tumor necrosis factor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β), IL6 와 같은 염증성 사이토 카인 (pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 자신의포식작용을 증가시키거나 자연살해세포, 수지상세포 등의 선천면역의 활성을 유도하는 한편 외부로부터 유입된 항원을 면역 T 세포에 전달하여 세포의 활성화와분화를 조절함으로써 적응 면역의 활성에도 기여하는 것으로 알려져 있다. 또한NK cell은 세포 독성 과립을 방출하여 암세포를 직접적으로 살해할 수 있으며,interferon-γ (IFN-γ)와 같은 사이토 카인을 분비하여 대식세포 및 T 세포를 동시에 활성화할 수 있다. 따라서 인체의 면역기능 저하는 결국 감염 및 질병의 발생뿐만 아니라 종양의 발생 및 암환자의 회복을 지연시키는 요인이 되기도 한다.이러한 관점에서 면역자극은 체내의 면역 방어체계 향상을 위한 중요한 전략으로대두되고 있으며 이러한 요구에 부응하여 면역 잠재력을 향상시킬 수 있는 천연물 및 식이 소재 개발에 관심이 집중되고 있다. 또한 최근 연구에 의하면 천연물에서 추출한 다당류 및 단백질과 같은 고분자 물질들은 의약품에 비해 비교적 낮은 독성을 나타내는 장점을 가지고 있으며 생체내에서 대식세포, 림프구, 자연 살해 세포 등 면역세포의 활성화를 통해 면역조절 활성을 증진시킨다고 알려져 있다.해양에 서식하는 다양한 해양생물들 중 해조류는 다량의 무기질을 함유하고 있을뿐만 아니라, 다당류의 함량이 높아 다양한 생리활성을 가지는 천연자원으로 그중요성이 점차 주목받고 있으며, 특히 갈조류의 경우 항암, 항염증 및 항산화 등생리활성 물질이 풍부한 것으로 알려져 있다. 갈조류 중 모자반목 모자반과에속하는 괭생이 모자반 (Sargassum horneri)은 우리나라 동해안과 남해안 및일본의 전연안과 중국에도 보편적으로 분포하는 종으로 우리나라에서 현재까지는해안에 밀려와 쌓여 악취를 풍기는 원인으로써 사료로 이용되는 점 이외에는해상에서 인간에게 피해를 입히는 해조류로 인식되고 있었다. 그러나 일본의경우 오래 전부터 식용으로 이용되고 있는 것으로 보고되고 있으며 해조류추출물 및 이차대사물들이 가지는 건강증진효과로 인해 최근 들어 식단에서주요식품의 한 급원으로 인식되기 시작하여 우리나라에서도 점차 괭생이모자반의 건강기능성에 대한 연구가 활발해지고 있다. 괭생이 모자반에 대한현재까지의 연구를 살펴보면, 괭생이 모자반 추출물이 골다공증 방지 기능이있는 것으로 보고되어 있다. 또한 괭생이 모자반의 추출물이 항산화 및항암효과를 가지고 헤르페스 바이러스 (Herpes simplex virus type 1)의 억제효과가 있음이 보고되었다.Zebrafish(Denio rerio)는 인간의 유전자 정보 및 장기 체계가 높은 상동성을보이는 척추 동물로, 세대 기간이 2-3 개월로 짧고 발생이 매우 빨라 생후 첫3 일 안에 중요한 기관이 모두 형성되는 장점이 있어 유전학, 생물학 등에서 널리사용되고 있으며, 최근 선천성 면역계와 후천 면역계가 잘 발달되어 있기 때문에면역연구에 유용한 동물 모델이다.장내 정상 균총 (normal flora)은 숙주의 대사과정을 효율적으로 활용하며안정적인 군집을 형성함과 동시에, 인간과 공생하면서 외부의 위험을 차단하는기능도 함께 수행한다. 외부에서 유입된 병원균은 장내 상피 세포에 부착하기위하여 우선 정상 균총과 경쟁하게 된다. 정상 균총은 특히 장내 점막면역계의발달과 성숙에 필수 요소로서, 특정 미생물군은 특정 종류의 면역세포의 분화와황성화를 유도하여 면역 관용 (immune tolerance)와 면역 자극 (immunestimulation) 간의 균형을 조절한다. 한편 장내 점막 면역계의 발달에는 고블렛세포 (goblet cell) 이 관여하는 것으로 알려져 있다.본 연구에서는 RWA264.7 대식세포에 괭생이 모자반의 효소 추출물을 처리하여이들 이 세포생존, 사이토 카인 및 NO 생성에 미치는 영향을 비교하는 한편mitogen-activated protein kinases (MAPKs) 신호전달경로 및 iNOS, COX-2 활성화등에 미치는 영향을 관찰하였으며, 또한 제브라 피쉬 동물 모델에서 장내 점막형성 및 상피세포의 면역에 관여하는 고블렛 세포을 관찰하였으며, 신장에서의조혈모 세포에서의 면역세포들의 구성을 확인함으로서 이들의 면역증강활성 및분자적 작용기전을 규명하고, 면역증강 소재 로서의 개발 가능성을 알아보고자하였다
Author(s)
Hwang, Jin
Issued Date
2021
Awarded Date
2021. 8
Type
Dissertation
URI
https://dcoll.jejunu.ac.kr/common/orgView/000000010214
Alternative Author(s)
황진
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
전유진
Table Of Contents
ABSTRACT . 1
INTRODUCTION 2
MATERIALS AND METHODS 4
Reagents and chemicals . 4
Preparation of crude polysaccharides from S.hornei (SHC.Ps) 4
Monosaccharide composition analysis of crude polysaccharides. 5
FT-IR characterization of crude polysaccharides. 5
Analysis of polysaccharides, polyphenols and sulfate contents of crude polysaccharides from S. horneri celluclast-enzyme extract. 5
Acid hydrolysis for depolymerization of SHC.Ps. 5
Characterization of molecular weight of SHC.Ps by Size-exclusion chromatography Multi Angle Light Scattering (SEC-MALS) . 6
Mass spectrometric analysis of SHC.Ps. 6
Preparation of probiotics . 7
Cell culture . 7
Cytotoxicity and NO production by the combination of SHC.Ps and LAB induced in RAW 264.7 macrophages 7
Phagocytosis assay 8
Fish maintenance and diet preparation . 8
Flow cytometric analysis on immune-enhancing effects of the combination of SHC.Ps and LAB in zebrafish . 9
Histopathology on immune-enhancing effects of the combination of SHC.Ps and LAB in zebrafish intestinal 9
Pro-inflammatory cytokines production against the combination of SHC.Ps and LAB in zebrafish . 9
Western blot 10
Statistical analysis 10
RESULTS 11
Extraction of S.horneri and General and monosaccharides composition of SHC.Ps 11
FT-IR characterization of SHC.Ps 13
Determination of absolute molecular weight and mass spectrometric analysis of SHC.Ps. 15
Effects of the combination of SHC.Ps and LAB on cell viability and NO production 16
Effects of the combination of SHC.Ps and LAB on for immune-enhancing activity using phagocytic analysis 17
Effect of the combination of SHC.Ps and LAB on immune-enhancing activity of pro-inflammatory cytokines production . 23
Effect of the combination of SHC.Ps and LAB on immune-enhancing activity in though the JNK/p38 pathway 25
Effect of the combination of SHC.Ps and LAB on immune-enhancing activity in zebrafish kidney using FACS analysis 27
Effect of combination of SHC.Ps and LAB on immune-enhancing activity in zebrafish intestinal using the histological analysis 30
DISCUSSIONS . 32
CONCLUSION 35
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
Hwang, Jin. (2021). Immune-enhancing activities of Combination of the Sargassum horneri polysaccharides and Lactobacillus plantarum in macrophages and zebrafish model
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General Graduate School > Marine Life Sciences
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