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제주전통음식 쉰다리의 군집조사 및 프로바이오틱스로의 가능성

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Alternative Title
Phylogenetic diversity of Jeju traditional fermented food Shindari and its possibility as probiotics
Abstract
The technology of the aquaculture industry is rapidly developing due to the problem of limited production, which is due to the increasing global demand for aquatic products. However, due to the indiscriminate use of antibiotics and high-density aquaculture to increase production, direct and indirect damage to the aquaculture industry is increasing. In order to solve this problem, a lot of research on natural antibiotics has been conducted recently. Specifically, quite a bit of research on makgeolli has already been conducted, but the amount of research on shindari, which is made from similar raw materials to makgeolli, is insufficient. Shindari is a traditional Jeju makgeolli made from leftover barley rice fermented with yeast. Accordingly, this researcher identified the bacterial community in shindari, a traditional Jeju fermented food, confirmed the groups with antibacterial activity, and tested the stability, acid resistance, base resistance, and intestinal adhesion properties to investigate the possibility of using it as a probiotic.
The hawthorn used in this experiment was found to have an acidity level of 1.9% and a pH of 4.94. As a result of counting the colonies of the hawthorn bacteria, the average count was MRS 1.8×106 CFU/g, YM 2.2×106 CFU/g, TSA 3.0×106 CFU/g and R2A 2.7×106 CFU/g. As a result of analyzing the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the bacteria isolated from fifty samples, using NCBI and EZbiocloud, it was divided into 2 phyla, 2 classes, 3 orders, 5 families, and 7 genera. With a total of 112 strains, Firmicutes was the dominant type, with 73% of the organisms being Firmicutes, and the remaining 27% being Proteobacteria. In addition, the genera Pediococcus and Bacillus were the most dominant, with 25% each, followed by the Cronobactergenus at 22%, the Enterococcus genus at 16%, the Aneurinibacillus genus at 5%, the Klebsiella genus at 4%, and the Paenibacillus genus at 2%.
The antibacterial activity of the isolate of shindari was observed with two gram-positive bacteria, Streptococcus iniae and Streptococcus parauberis, 6 gram-negative bacteria - Vibrio alginolyticus, Vibrio harveyi and Edwardsiella tarda, fish disease bacteria, 2 gram-negative bacteria - Escherichia coli and Salmonella enterica, and 3 other types. Antibacterial activity was measured using gram-positive bacteria cultures of Micrococcus luteus, Streptococcus mutans, and Listeria monocytogenes.
As a result, it was confirmed that growth inhibitory rings were formed for all bacteria except the fish disease Photobacterium damselae subsp. piscicida and S. mutans, which is a harmful bacterium found in the human body. In S. parauberis, a fish disease bacterium, Y19 (Bacillus siamensis) showed the largest growth inhibitory ring at 36.8 mm in length. In addition, T19, T25, and T21 showed remarkable antibacterial activity in the order of 33.7 mm, 33.6 mm, and 32.7 mm.
Among the 121 isolates, it was confirmed that 3 strains of the 15 strains with broad antibacterial activity produced β-hemolysis, 3 strains of α-hemolysis, and 8 strains of γ-hemolysis. In addition, it was confirmed that no carcinogen-related enzymes and substances were produced in all 9 strains having γ-hemolysis hemolysis in the harmful metabolites and harmful enzyme production experiments. Among the 9 strains, the casein hydrolysis ability was positive in 7 of them, DNase activity in 8 of them, and lipase activity in 7 of them.
In addition, cellulase activity was shown in 6 strains, and in each medium containing Tween 20, Tween 40, Tween 60, and Tween 80, only 6 strains were shown to degrade all Tween medias of different molecular weights. As a result of resistance in artificial bile, M28 and Y19 had the best resistance, and as a result of resistance in artificial gastric juice, it was confirmed that R10, T19, and Y19 were the best. In addition, the optimum temperature of all candidate strains was 20-35℃, and most of the selected strains were able to grow in a NaCl environment of 0%-6% concentration. As a result of the intestinal adhesion test using Musin, the highest strain was 88%. Based on the above study results, Bacillus siamensis Y19 was selected as a candidate strain for probiotics.Bacillus siamensis Y19 showed positive results from gram staining, and both catalase activity and oxidase activity tests showed positive results. It was confirmed that it was not active on the carcinogen β-glucuronidase, and it was found to be similar to the previously reported study on carbohydrate utilization of Bacillus siamensis.Finally, Bacillus siamensis Y19 is a safe strain with excellent antibacterial properties for fish and human body, and it is judged that it could be used in various ways as a safe seed strain for the human body, and as a host in the future by passing all the standards so that it may be used just as other probiotics are.
In addition, it could be used as an eco-friendly alternative to antibiotics pending additional fish experiments, etc., and it is expected to be used and effective as a probiotic in various other fields.
전 세계적으로 늘어나는 수산물 수요에 따른 한정적인 생산량의 문제로 수산 양식 산업의 기술은 빠르게 발전하고 있다. 그러나 무분별한 항생제 사용과 생산 량을 늘리기 위한 고밀도 양식 등으로 인하여 직 간접적으로 수산 양식 산업에 서 막대한 피해가 증가하고 있다. 이를 해결하기 위하여 최근 천연항생물질에 대 한 많은 연구가 진행되고 있다. 그 중 막걸리에 대한 연구는 많은 연구되어 있으 나 막걸리와 비슷한 원료로 제조되는 쉰다리에 대한 연구는 미비한 실정이다. 쉰 다리는 먹다 남은 보리밥을 활용하여 누룩을 첨가하여 발효시킨 제주 전통 막걸 리를 이야기 한다. 이에 따라 본 연구자는 제주 전통 발효식품인 쉰다리 내의 세 균의 군집을 파악하고 항균 활성을 지닌 군들을 확인하였으며, 안정성 및 내산 성, 내염기성, 장부착능 등을 실험하여 프로바이오틱스로의 사용 가능성을 알아 보았다. 본 실험에서 사용된 쉰다리의 산도는 1.9%, pH는 4.94로 측정되었으며, 쉰다리 에서 분리한 균의 16S ribosomal RNA 유전자의 염기서열을 NCBI와 EZbiocloud를 이용하여 분석한 결과 2문(Phylum) 2강(Class) 3목(Order) 5과 (Family) 7속(Genus)으로 총 112 균주로 Firmicutes문 73%와 Proteobacteria 문 27%로 Firmicutes문이 우점문인 것으로 나타났다. 또한, Pediococcus 속, Bacillus 속이 각각 25%로 가장 우세하였고, 다음으로 Cronobacter 속 22%, Enterococcus 속 16%, Aneurinibacillus 속 5%, Klebsiella 속 4%, Paenibacillus 속이 2% 순으로 구성되어 있는 것으로 나타나났다. 쉰다리 분리 균주의 항균 활성은 2종의 그람양성균 Streptococcus iniae , Streptococcus parauberis 와 6종의 그람음성균 Vibrio alginolyticus , Vibrio harveyi 및 Edwardsiella tarda 등 어류질병 세균과 2종의 그람음성균 Escherichia coli , Salmonella enterica 와 3종의 그람양성균 Micrococcus luteus , Streptococcus mutans, Listeria monocytogenes 균을 이용하여 항균 활 성을 측정하였다. 그 결과 어류질병 세균 Photobacterium damselae subsp. piscicida 와 인체 유해세균 S.mutans 를 제외한 모든 균에 대해서 생육저해 환을 형성하는 것을 확인하였다. 어류질병 세균인 S. parauberis 에서 Y19( Bacillus siamensis )가 균체에서 36.8 mm로 가장 큰 생육저해 환을 나타냈다. 그 외에도 T19, T25, T21 가 33.7 mm, 33.6 mm, 32.7 mm 순으로 눈에 띄는 항균활성 능력을 보여주었다. 분리균주 121균주 중 넓은 항균활성을 보인 15균주 중 3균주가 β-hemolysis 3균주가 α-hemolysis 8균주가 γ-hemolysis을 생성하는 것으로 확인되었다. 또 한, 유해대사산물과 유해효소생성 실험에서 γ-hemolysis 용혈을 가지는 9균주에 서 모두 발암관련 효소와 물질이 생성되지 않는 것을 확인하였다. 9균주 중 Casein가수 분해능은 7균주에서 양성으로 나타났고, DNase활성은 8 균주에서 lipase활성은 7균주에서 나타났다. 또한, cellulase활성은 6균주에서 나타났고 Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80이 포함된 각각의 배지에서는 6 균주만이 분자량이 다른 tween을 모두 분해하는 것으로 나타났다. 인공담즙에서 의 저항성결과 M28, Y19이 가장 뛰어난 내성을 가졌으며 인공위액에서의 내성 결과 R10, T19, Y19가 가장 뛰어남을 확인 할 수 있었다. 또한 모든 후보 균주 의 최적온도는 20-35℃ 로 0%-6% 농도의 NaCl 환경에서 대부분의 선별균주는 생장이 가능하였다. musin을 이용한 장 부착 실험 결과 가장 높은 균주는 88% 로 나타났다. 위 연구 결과를 토대로 Bacillus siamensis Y19 T 를 probiotics 후 보 균주로 선정하였다. Bacillus siamensis Y19 T 는 그람염색 결과 양성으로 나타났으며, catalase activity, oxidase activity 실험 결과 모두 양성을 나타냈다. 발암효소인 β -glucuronidase에는 활성을 띄지 않음을 확인할 수 있었으며, 이 전에 보고된 Bacillus siamensis 의 탄수화물 이용 연구결과와 유사한 것으로 나타났다. 최종적으로 Bacillus siamensis Y19 T 는 어류 및 인체 항균에 뛰어나며 안정성 을 가진 균주로 다른 probiotics로 사용될 수 있는 기준을 모두 통과하여 향후 인체 및 숙주에 안전한 종균으로 다양하게 활용이 가능할 것으로 판단된다. 또한 추가적인 어류 실험 등을 통하여 친환경적인 항생제 대체제로도 이용이 가능할 수 있으며 그 외 다양한 분야에서 생균제로 사용 및 효과가 있을 것으로 사료된다.
Author(s)
유영수
Issued Date
2021
Awarded Date
2021. 8
Type
Dissertation
URI
https://dcoll.jejunu.ac.kr/common/orgView/000000010245
Alternative Author(s)
Ryu, Young Soo
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 해양생명과학과
Advisor
허문수
Table Of Contents
제 1장 제주 전통음식 쉰다리에서 분리된 세균의 군집 탐색 및 항균조사 1
1.1. 서 론 1
1.2 재료 및 방법 4
1.2.1. 시료구입 4
1.2.2. 쉰다리 시료의 pH와 산도 4
1.2.3. 쉰다리 균주의 분리 및 배양 5
1.2.4. 16S rRNA 유전자의 염기서열 계통분석 8
1.2.4.1. Genomic DNA 추출 및 유전자 증폭 8
1.2.4.2. 염기서열 및 계통학적 분석 10
1.2.5. 쉰다리 세균의 항균 활성 11
1.3 결과 및 고찰 18
1.3.1. 쉰다리 시료의 pH와 산도 및 쉰다리 균주의 분리배양 18
1.3.2. 쉰다리 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 및 계통학적 분석 20
1.3.3. 쉰다리 세균의 항균 활성 탐색 25
1.4 제 1장 종합고찰 29
Ⅱ. 제 2장 쉰다리에서 분리된 세균의 프로바이오틱스로의 가능성 연구 32
2.1. 서 론 32
2.2. 재료 및 방법 35
2.2.1. 용혈성 및 유해대사산물과 유해효소 생성여부 시험 35
2.2.2. 고분자 유기물질 분해여부 시험 37
2.2.3. 인공 위액 및 인공 담즙에서의 내성 시험 38
2.2.4. 온도, pH, NaC에서의 생육 시험 39
2.2.5. 장 부착능 시험 40
2.2.6. 그람염색 및 생화학적 특성 41
2.2.7. API Kit zym 42
2.2.8. API Kit 50 CHB 43
2.2.9. 항생제 시험(Antibiotic test) 44
2.3. 결과 및 고찰 45
2.3.1. 용혈성 및 유해대사산물과 유해효소 생성여부 시험 45
2.3.2. 고분자 유기물질 분해여부 시험 47
2.3.3. 인공 위액 및 인공 담즙에서의 내성 시험 49
2.3.4. 온도, pH, NaC에서의 생육 시험 52
2.3.5. 장 부착능 시험 55
2.3.6. Probiotics 선정 56
2.3.7. 그람염색 및 생화학적 특성 56
2.3.8. API Kit zym 57
2.3.9. API Kit 50 CHB 59
2.3.10. 항생제 시험(Antibiotic test) 612.4. 제 2장 최종 고찰 62
Ⅲ. 국문요약 66
Ⅳ. 참고 문헌 68
Ⅴ. 감사의 글 87
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
유영수. (2021). 제주전통음식 쉰다리의 군집조사 및 프로바이오틱스로의 가능성
Appears in Collections:
General Graduate School > Marine Life Sciences
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