급성콩팥손상 모델에서 머캅토에탄올의 보호 효과

Abstract

콩팥 허혈-재관류 손상(ischemia-reperfusion injury, IRI)은 급성콩팥손상(acute kidney injury, AKI)의 대표적인 모델로서 요세관 상피세포(tubular epithelial cell)의 세포사(cell death)를 유도한다. DNA 이중가닥 절단(DNA double-strand breaks)은 허혈-재관류 손상으로 인한 요세관 세포사의 주요 원인 중 하나이다. 다른 연구팀에서는 머캅토에탄올(2-mercaptoethanol, 2-ME)이 송아지의 가슴샘(thymus)과 소 배아(embryo)에서 정제된 DNA에서 DNA 이중가닥 절단을 보호한다고 보고하였다. 이를 바탕으로 본 연구자는 머캅토에탄올 투여가 DNA 이중가닥 절단을 약화시켜 허혈-재관류로 인한 콩팥의 기능 저하와 조직학적 손상을 감소시키는지 여부를 확인하였다. 콩팥 허혈-재관류 손상 이후 콩팥 기능이 저하되고 조직학적 손상이 유발되었다. 그러나 머캅토에탄올의 전처치(pre-treatment)와 후처치(post-treatment)는 허혈-재관류로 인한 콩팥의 기능 저하와 요세관 손상을 유의하게 감소시켰다. 그리고 콩팥에서 허혈-재관류 손상은 DNA 이중가닥 절단을 유도하였으며 주로 콩팥 요세관 상피세포에서 관찰되었다. 그러나 머캅토에탄올을 투여한 생쥐의 콩팥에서는 허혈-재관류로 인한 DNA 이중가닥 절단이 억제되었다. 허혈-재관류 손상 후 DNA 손상 반응(DNA damage response, DDR)의 신호전달경로(signaling pathway)의 upstream sensor kinase인 ataxia telangiectasia mutated(ATM)와 ataxia telangiectasia and Rad3 related(ATR)의 활성이 증가하였고, 머캅토에탄올을 투여한 콩팥에서는 ATM의 활성만 더욱 향상되었다. 또한 ATM 단백질의 신호전달경로에서 downstream effector kinase를 측정하였을 때, 머캅토에탄올 투여는 허혈-재관류로 인해 감소된 checkpoint kinase 1(Chk1), checkpoint kinase 2(Chk2), X-ray repair cross-complementing protein 1(XRCC1)의 활성을 현저하게 증가시켰다. 이는 허혈-재관류 손상에서 머캅토에탄올이 ATM 신호전달경로의 활성을 유도시킨다는 사실을 알 수 있다. 다음으로 허혈-재관류 손상을 받은 콩팥에서 glutathione peroxidase 4(GPX4), catalase, copper-zinc superoxide dismutase(CuZnSOD), manganese superoxide dismutase(MnSOD)의 단백질 발현이 모두 감소하였다. 그러나 허혈-재관류 손상에 노출된 콩팥에서 머캅토에탄올 투여는 GPX4 단백질의 발현만 유의하게 향상시켰다. 머캅토에탄올에 의해 증가된 GPX4 발현을 억제하였을 때, 머캅토에탄올 투여로 인해 감소된 DNA 이중가닥 절단이 다시 유발되었고, ATM 관련 신호전달경로가 감소하였으며, 이를 통해 허혈-재관류로 인한 콩팥의 기능 저하와 요세관 손상을 다시 유도하였다. 마지막으로, 허혈-재관류 손상은 mitogen-activated protein kianse(MAPK) 중 p38과 extracellular signal-regulated kinase(ERK)의 활성을 증가시켰고, protein kinase B(AKT)의 활성을 유도하였다. 그리고 콩팥 허혈-재관류로 손상받은 생쥐에서 머캅토에탄올 투여는 p38, ERK, AKT의 활성을 더욱 증가시켰다. 그러나 머캅토에탄올에 의해 활성화된 p38, ERK, AKT가 GPX 발현과 관련이 있는지 알아보기 위해서는 추가적인 연구가 필요하다. 결론적으로 본 연구자는 머캅토에탄올이 콩팥 허혈-재관류 손상에서 GPX4의 발현을 증가시키고 ATM 관련 신호전달의 활성을 통해 DNA 이중가닥 절단을 억제함으로써 콩팥의 기능 저하와 요세관 손상을 보호함을 입증하였다.|Kidney ischemia-reperfusion injury (IRI) is a major cause of acute kidney injury (AKI) and is characterized by tubular cell death. DNA double-strand breaks is one of major sources of tubular cell death induced by IRI. 2-Mercaptoethanol (2-ME) is protective against DNA damage in some cell line. The aims of this study were to determine whether treatment with 2-ME attenuated DNA double-strand breaks, resulting in reduced kidney dysfunction and tubular injury. Kidney IRI or sham-operation in mice was carried out. The mice were treated with 2-ME, Ras-selective lethal 3 (RSL3, a potent inhibitor of glutathione peroxidase 4 (GPX4)), or vehicle. Kidney function were assessed by plasma creatinine and blood urea nitrogen (BUN) concentration. Kidney tubular injury was assessed percentage of injured tubules. DNA double-strand breaks were detected by western blot analysis, immunohistochemistry, and immunofluorescenc using antibody for H2A.X variant histone phosphorylated at serin 139 (γH2AX). Phosphorylation of DNA damage response (DDR) kinases, mitogen-activated protein kinase (MAPK), and protein kinase B (AKT) and expression of antioxidant enzymes, and solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11) were measured by western blot analysis. Treatment with 2-ME significantly attenuated kidney dysfunction and tubular injury after IRI. Furthermore, post-treatment with 2-ME improved kidney dysfunction and tubular damage during IRI. Treatment with 2-ME significantly reduced DNA double-strand breaks after IRI. Among upstream sensor kinase of DNA damage response (DDR), IRI induced ataxia telangiectasia mutated (ATM) and ataxia telangiectasia and Rad3 related (ATR) phosphorylation, but treatment with 2-ME more activated ATM after IRI. IRI decreased phosphorylated of downstream effector kinase including checkpoint kinase 1 (Chk1), checkpoint kinase 2 (Chk2), and X-ray repair cross-complementing protein 1 (XRCC1) in IRI-subjected kidneys. However, treatment with 2-ME significantly activated downstream kinase after IRI. Theses data suggest that 2-ME activates ATM-mediated DDR signaling pathway. IRI reduced expression of kidney antioxidant enzymes including catalase, GPX4, and superoxide dismutases (SOD). However, 2-ME dramatically upregulated GPX4 in IRI-subjected kidneys. Furthermore, inhibition of GPX4 developed adverse IRI consequences including kidney dysfunction, tubular injury, and DNA double-strand breaks as well as inactivation of ATM-mediated DDR signaling pathway after IRI in 2-ME-treated kidneys. In addition, IRI increased activation of p38 (p38), extracellular signal-regulated kinase (ERK) and AKT, but 2-ME significantly more increased their activation after IRI-subjected kidneys. Taken together with these data, 2-ME contributes to protection against DNA double-strand breaks after kidney IRI through GPX4 upregulation and ATM activation, resulting in protect kidney dysfunction and tubular injury.