Cloning and expression of two CYP19 cDNAs in protogynous wrasse, halichoeres tenuispinis

Abstract

P450 aromatase (P450arom, CYP19), a CYP19 gene product, is a member of the cytochrome P450 superfamily, which catalyzes the formation of aromatic C18 estrogen from C19 androgen. It has been reported that there are two types of P450arom gene in teleost fish, termed CYP19a, CYP19b, respectively. In this study, two CYP19 genes were isolated from the ovary and brain of protogynous wrasse (Halichoeres tenuispinis). CYP19a cDNA, isolated from the ovary cDNA library, is about 2 kb in length, which encodes 519 amino acids. The amino acid sequence of CYP19a has 71-77% homology with ovarian aromatase of other teleost fish. CYP19b cDNA was also isolated from brain cDNA using 5' and 3' rapid amplification of cDNA ends (RACE) analysis. The size of CYP19b cDNA is about 2.6 kb which encodes 496 amino acids. The deduced amino acid sequence has 61-81% homology with brain aromatase of other teleost fish. From Northern blot analysis, a single 2.6Kb transcript of CYP19b and a 2.2 kb transcript of CYP19a were observed in the brain and ovary, respectively. The tissue-specific expression of CYP19 genes was analysed by RT-PCR assay. CYP19a was expressed highly in the ovary, and less in other tissues, but not in the intestine. However, CYP19b expression was higher in the brain and ovary, but lesser in the other several tissues. The expression levels of CYP19 genes were also determined in the ovary and brain during reproductive period. From this result, the difference and change of expression levels of the CYP19 genes might be correlated with the physiological and reproductive functions of estrogen in reproductive period. In addition, expression of CYP19 in non-steroidogenic tissues of wrasse might suggest its novel function to be further investigated.

CYP19 유전자의 발현에 의해 생성되는 P450 aromatase (CYP19, P450 arom)는 웅성호르몬인 안드로겐을 자성호르몬인 에스트로겐으로 변환시키는 효소이다. 모든 척추동물에서 에스트로겐은 다양한 측면에서 중요한 기능을 하며, 특히 어류에서는 생식소의 분화 및 발달, 뇌에서의 성적 특성 및 행동에 관계된 신경내분비학적 면에 서 필수적인 기능을 한다고 알려져 있다. 어류에서는 두 가지 타입의 aromatase가 있 다고 알려져 있는데, 난소 특이적인 CYP19a와 뇌 특이적인 CYP19b가 그것이다. 본 연구에서는 암컷의 일부가 일생 중에 성전환 하는 제주산 놀래기에서 두 가지 타입 의 CYP19 유전자를 분리하였고, 성숙 및 산란시기에 걸친 발현양상을 비교하였다. CYP19a cDNA는 놀래기의 난소 cDNA library screening에 의해 분리되었으며, 총 염기서열의 길이는 2020 bp로, 1557 bp의 open reading frame (ORF)을 포함하며, 425개의 아미노산을 구성하는 것으로 나타났다. 뇌 특이적인 CYP19b cDNA는 5' and 3' rapid amplification cDNA ends (RACE) 방법으로 분리되었으며, 1488 bp의 ORF를 포함하는 2666 bp의 염기서열로 구성, 496개의 아미노산을 구성하는 것으로 추정된다. 놀래기의 난소와 암컷의 뇌에서 성숙 및 산란기 동안의 두 유전자의 발현양상을 RT-PCR 방법으로 분석하였으며, 전사체의 크기 및 수를 알아보기 위하여 Northern blot analysis를 실시하였다. 난소 특이적인 CYP19a는 난소에서는 전 시기에 걸쳐 강 하게 발현되었으며, 특히 산란기에 속하는 7월경에 가장 강하게 발현된 것으로 나타 났다. 뇌 특이적인 CYP19b는 뇌에서 산란 및 퇴화기인 8월로 갈수록 점차 발현양이 증가하는 것으로 나타났다. 이는 놀래기의 생식주기와 관련된 생식소의 발달과 성적 행동과 관련된 뇌에서의 에스트로겐의 합성과 직접적인 관련이 있다고 여겨진다. 그 외 정소, 간, 아가미, 신장, 비장, 근육, 장, 심장 등의 조직에서도 CYP19a와 CYP19b 의 발현 여부를 살펴보았으며, 이를 통해 다양한 조직에서의 aromatase의 기능에 관 해 추정해 볼 수 있었다. 또한 난소와 뇌에서 분리된 mRNA로 Northern blot analysis를 한 결과, 각각 2.2 kb, 2.6 kb정도의 전사체를 확인할 수 있었다. 놀래기의 CYP19a는 black porgy, sea bass의 CYP19a와 83%, CYP19b는 Nile tilapia의 CYP19b와 81% 의 상동성을 나타냈으며, 계통유전학적 분석을 통해 분리된 두 유전 자가 서로 다른 타입임을 확인할 수 있었다.