Improvement of ginsenoside content in Korean Wild Ginseng (Panax schinseng Nees) root cells induced by γ-irradiation

Abstract

산삼(Panax schinseng Nees)은 아시아에서 의약품과 건강보조제 등으로 가장 널리 사용되는 것 중 하나이다. 산삼의 성분 중에서 사포닌은 30종 이상 함유되어 있고，사포닌의 효능은 체력강화와 면역력증가 등 여러가지 효과가 있다. 본 연구는 산삼의 부정근에 사포닌 함량을 증가 시키기 위해서 감마선 조사를 수행하였다. 돌연변이 유도를 위한 60CO 감마선 조사 선량은 5, 10, 25, 50, 75, 100, 200Gy로 산삼의 부정근에 각각 처리하였고, 각각의 조사선량에서 생존한 개체로 부터 돌연변이체를 선발하였다. 산삼 세포주는 삼각플라스크와 바이오리액터에서 30일간 배양하여 선발하였다. 돌연변이체 선발기준은 산삼세포주 뿌리의 2차근 수, 길이, 직경, 생장율 및 조사포닌 함량의 5가지 요인으로 대조구와 비교하여 선발되었다. 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rb2함량은 HPLC-PDA 검출기로 측정하였고, 검량선법으로 정량하여 대조구와 비교하였다. 산삼의 부정근에 방사선을 조사한결과 50Gy이하에서는 형태적 특성이 대조구와 유사하였다. 50Gy이상의 선량을 처리한 부정근에서는 생리적 장애로 인한 성장억제 및 갈변 현상이 발생하였고, 형태적 특성이 대조구와 차이가 있는 4개의 세포주를 선발하였다. 삼각플라스크에서 배양한 세포주의 형태적 특성과 조사포닌 함량을 비교한 결과 세포주1은 대조구보다 2차근 수, 길이와 생장율은 낮았지만 대조구에 비해서 직경이 31.3%, 조사포닌이 40.6%증가하여 다른 세포주에 비해서 가장 높게 나타났다. 4개의 진세노사이드 (Rg1, Re, Rb1, Rb2) 총함량은 세포주1이 대조구의 진세노사이드 함량보다 60% 높게 나타났다. 바이오리액터에서 배양한 세포주들의 형태적 특성과 조사포닌 함량을 비교한 결과 세포주1의 2차근 수와 길이는 삼각플라스크 배양에서와 유사한 형태적 특성이 관찰되었다. 반면에 생장율은 대조구와 유사하였고, 조사포닌 함량은87.3%로 삼각플라스크에서 보다2.2 배 이상 증가했다. 4개의 진세노사이드 총함량은 세포주1 이 대조구의 진세노사이드 함량보다 126%로 삼각플라스크에서 보다 2.1 배 증가하였다. 결과적으로 삼각플라스크와 바이오리액터에서 배양한 4개의 세포주 중에서 조사포닌 함량이 가장많은 돌연변이세포주1은 2차근 수와 길이가 대조구 보다 낮았으나, 뿌리의 직경과 사포닌함량이 높게 나타났다. 또한 바이오리액터 배양은 삼각플라스크에 비해서 생장율과 진세노사이드 함량이 높게 나타났다. 바이오리액터는 공기의 순화 및 영양배지의 공급이 일정하기때문에 삼각플라스크에서 보다 생육환경이 적합하여 산삼의 부정근 배양에 유용한 배양시스템으로 사료된다. 본 연구에서 수행한 산삼의 부정근에 방사선 조사방법은 사포닌 함량이 증가된 돌연변이 산삼 세포주을 유도하는데 효과적이었다. 방사선 처리에 의해서 유도된 돌연변이 세포주는 2차 대사산물의 함량변화와 관련된 유전자 규명에 도움이 될 수 있을 것으로 기대된다.

Panax schinseng Nees (Korean wild ginseng) is one of the oldest and the most widely used herbal medicines for the oriental people, more than 30 ginsenosides were identified. In order to evaluate effects of γ-irradiation on adventitious root growth and ginsenoside content, adventitious roots of Panax schinseng were treated with γ-ray of 5, 10, 25, 50, 75, 100 and 200Gy to induce mutation. Cell lines were cultured in flask and bioreactor for 30 days and selected based on the length, number, growth ratio, diameter and crude saponin content of the irradiated adventitious roots. The contents of ginsenosides Rb1, Rb2, Rg1, and Re in wide type and selected cell lines were evaluated by HPLC-PDA detector with digoxin as the internal standard. After irradiation, below 50Gy, the morphology and crude saponin content of irradiated adventitious root were similar with that of non-irradiated adventitious root. Otherwise, above 50Gy, the morphology and crude saponin content were different. Therefore, the dosage over 50Gy was considered as adequate for the selection of mutant cell lines of schinseng. After growth 30 days in flask, 4 cell lines were selected according to the the morphology and crude saponin content. In cell line 1, the values of secondary root number, length and growth ratio were decreased, but the values of secondary root diameter and crude saponin were increased 31.3%, 40.6% respectively compared to control. Total content of 4 ginsenosides was increased 60% compared to control. In bioreactor, the values of secondary root number and length were decreased, growth ratio was similar with that of control. The value of secondary root diameter and crude saponin in bioreactor were increased 22.7%, 87.3% respectively compared to control. Total content of 4 ginsenosides were increased 126% repectively compared to control. Although the values of secondary root number and length were lower than control in flask and bioreactor, interestingly, the diameter of secondary root increased compared with that of control. The value of growth ratio was similar with that of control in bioreactor, increased compared with that of flask. Crude saponin content in bioreactor was increased by 2.2 times that of the flask, ginsenoside content was increased 2.1 times that of the flask. In this study, we selected cell lines with a significantly increased biomass productivity and ginsenoside content in bioreactor culture compared with that of flask culture, probably due to their better nutrient status and low-stress environments. Based on the results obtained in this report, gamma irradiation is powerful and useful tool for the enhancement of production of secondary metabolites and for the bioreactor culture system, especially for ginsenoside. This result suggests that gamma irradiation might have triggered the enzyme activities for the synthesis of ginsenosides. Further work will be required to investigate the related enzymes involved in the enzymatic biosynthesis of ginsenosides.