옥돔 및 틸라피아 비늘 효소가수분해물의 생리활성

Abstract

Part 1. 옥돔(Branchiostegus japonicus)비늘 효소가수분해물의 생리활성 콜라겐에서 열변성으로 유도되는 젤라틴은 대부분 소나 돼지의 가죽, 뼈 그리고 동물성 부산물을 이용하여 생산되어져 왔으며, 현재 식품, 건강보조식품, 화장품, 의료용품 등 다양한 분야에서 사용되고 있다. 그러나 광우병 및 구제역 등으로 인하여 원료 사용에 제약을 받고 있다. 본 연구에서는 미이용 자원으로서 옥돔의 가공부산물이며 위생적 생산이 가능성 옥돔 비늘로부터 gelatin을 추출 후 효소가수분해를 통하여 식품 및 화장품 원료로서의 이용가능성을 살펴보았다. 옥돔 비늘의 일반성분은 수분함량은 8.5%, 조지방 함량은 0.4%, 회분함량은 45%였고, 조단백질 함량은 46.1%이었으며, 옥돔 비늘 젤라틴은 수분 8.0%, 조단백 90.7%, 조지방 0.1%, 회분 0.4%으로 시판 틸라피아젤라틴의 수분 8.9%, 조단백 89.5%, 90.1%, 조지방 0.9%,0.3% 회분0.9 %이었으며, 투과도는 옥돔 비늘젤라틴 98.7%, 틸라피아 비늘 젤라틴(150 bloom과 200 bloom)의 99.3%, 99.5%이었고, 색도는 옥돔 비늘 젤라틴 명도 88.5, 적녹도 -0.4, 황청도 27.3, 틸라피아 비늘 젤라틴(150 bloom과 200 bloom) 명도 88.1, 87.8, 적녹도 -0.1, -1.7, 황청도 27.9, 25.4로 시판 틸라피아 비늘 젤라틴과 큰 차이를 보이지 않았다. 또한 겔강도는 옥돔 비늘 젤라틴 120.5g, 시판 틸라피아 비늘 젤라틴이 각각 156.5g(150 bloom), 182.7g(200 bloom)이었고, 녹는점은 옥돔 비늘 젤라틴 10℃, 시판 틸라피아 비늘 젤라틴이 각각 17 ℃(150 bloom), 19 ℃(200 bloom)로 젤라틴 물성은 시판 틸라피아 비늘 젤라틴에 비해 다소 떨어졌다. 옥돔 비늘의 gelatin 및 collagen 추출물의 아미노산 조성을 분석한 결과 옥돔 비늘의 collagen의 glycine조성은 우피유래 collagen에 비해 현저하게 낮게 나타났으며, hydroxyproline 조성은 펩신가용성 collagen 9.61%, 높은 조성을 보였으며, proline은 우피유래 collagen보다 현저하게 낮은 조성을 보였다. 또한 imino acid 함량도 펩신가용성 collagen 16.67%, 염가용성 collagen 13.99%, 산가용성 collagen 18.65%로 우피유래 collagen 20.29%보다 낮았으며, 옥돔 비늘의 gelatin 추출물의 경우 imino acid 조성이 20.50%로 우피 22.83%, 돈피 22.64% 유래 gelatin보다 낮게 나타났으며, glycine 조성도 옥돔 비늘 gelatin 19.30%로 우피 20.34% 및 돈피 유래 gelatin보다 낮은 함량을 보였다. 옥돔 비늘 유래 젤라틴을 가수분해하기 위해 4종의 단백질 분해효소 (α-chymotrypsin, alcalase, neutrase 및 trypsin)를 이용하여 추출한 시간대별 가수분해물의 가수분해도는 4종류의 효소 모두 가수분해반응 6시간까지 급격하게 가수분해도의 증가를 보였으나, 그 후에는 거의 일정하였다. 또한, 4종류의 가수분해물 중에서도 alcalase가 가장 효과적으로 옥돔 비늘 젤라틴을 가수분해하였으며, 가수분해반응 6시간 이후에 약 65%이상의 가수분해도를 나타내었다. 옥돔 유래 비늘 젤라틴 가수분해물들은 DPPH 라디칼과 과산화수소에 대하여 높은 시료 농도에서 소거활성을 보였으며, 이 중에서, nutrase에 의해 가수분해된 젤라틴 가수분해물이 가장 높은 DPPH 소거활성을 보였는데, 약 50%까지의 DPPH 라디칼 소거활성을 보였고, IC_(50) 값은 9.18㎎/㎖이었다. 그리고 과산화수소 소거활성은 α-chymotrypsin을 사용한 젤라틴 가수분해물에서 가장 높게 나타났으며, 시료의 농도가 증가함에 따라 과산화수소 소거활성도 증가하였다(IC_(50) 값: 9.74 ㎎/㎖). 일반적으로, 고혈압의 원인 물질이라고 알려진 Angiotensin-I 전환 효소 (ACE)의 저해활성은 단백질이나 펩티드와 연관이 깊은 것으로 알려져 있다. 따라서, 4종의 단백질 가수분해효소 (α-chymotrypsin, alcalase, neutrase 및 trypsin)를 이용하여 제조한 옥돔 비늘 유래 젤라틴 가수분해물의 ACE의 저해활성은 효소와 가수분해시간에 따라 제조된 옥돔 비늘 유래 젤라틴 가수분해물들은 ACE 활성을 명확히 저해시킨다는 것으로 나타났다. 특히, 다른 효소에 비하여 alcalase를 이용하여 제조된 젤라틴 가수분해물이 높은 ACE 저해작용을 가진다는 것으로 확인되었다. Alcalase 젤라틴 가수분해물의 최적 가수분해 조건을 확인하기 위해, 효소비를 10, 20, 50, 100, 200, 500(wt/wt)으로 하여 가수분해도를 측정한 결과, 옥돔 비늘 유래 젤라틴 대 효소의 비가 감소할수록, 즉 효소의 농도가 증가할수록 높은 가수분해도를 나타내었다. 또한, 젤라틴 대 효소의 비율이 10부터 100(wt/wt)까지 증가하면서 가수분해도가 60% 이상을 보이며 높게 나타났고, 200(wt/wt)부터는 가수분해도가 급격히 떨어졌다. 기질 대 효소비 100 (wt/wt)이 가수분해도에 대한 가장 우수한 효율성을 보였다. 옥돔 비늘 유래 젤라틴을 100(wt/wt)에서 기질농도를 1%, 3%, 5%, 10%, 20%로 각각 조절하였을 때 기질의 농도가 낮을수록 가수분해도는 증가하였지만, 기질 농도가 5% 이하일때는 거의 유사한 가수분해도를 보여 대량 생산 측면을 고려해 볼 때, 기질 농도 5%가 가장 적당하였다. Alcalase를 이용하여 pH 8.0, 50℃, 6hr, 기질 대 효소비는 100 (wt/wt) 및 기질 농도는 5%의 조건으로 가수분해 한 경우, 가장 높은 가수분해도를 확인하였고, 옥돔 비늘 유래 젤라틴의 최적가수분해조건에서 제조한 젤라틴 가수분해물로 다양한 농도별 (0.25, 0.5 및 1㎎/㎖)로 ACE 저해활성을 측정한 결과, ACE의 활성을 약 60%까지 억제하였고, 그것의 IC_(50) 값이 0.73 ㎎/㎖이었다. 단백질 가수분해효소 (α-chymotrypsin, alcalase, neutrase 및 trypsin)를 이용하여 제조한 옥돔 비늘 유래 젤라틴 가수분해물의 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 제조된 옥돔 비늘 유래 젤라틴 가수분해물들은 tyrosinase 저해활성은 낮은 농도에서는 저해활성이 전혀 나타나지 않았으며, 높은 농도에서 저해활성이 나타났다. 특히, 옥돔젤라틴 α-chymotrypsin 추출물 50㎎/㎖에서 53%, alcalase 추출물에서 64.7%의 억제 활성을 보였으나, 화장품 미백기능성 고시원료인 arbutin에 비해 현저하게 낮은 활성을 보여주고 있다. 옥돔 비늘 유래 젤라틴 가수분해물의 elastase 저해활성을 측정한 결과 α-chymotrypsin 추출물 50㎎/㎖에서 94.2%, alcalase 78.5%, neutrase 66.0%, trypsin 74.0%의 억제 활성을 보여주었다. 하지만 이는 화장품 미백기능성 고시원료인 빈랑자(Arecae Semen)추출물보다 현저하게 낮은 활성을 보여주고 있다. 따라서 본 연구를 통해 수산가공과정을 중 발생하는 부산물인 제주산 옥돔 비늘 젤라틴의 효소적 가수분해물의 항산화, 항고혈압, 미백, 주름개선 활성과 같은 기능성에 대한 체계적인 접근을 통하여 기능성 식품 및 화장품 소재로서 충분한 가치가 있다고 생각된다. Part 2. 틸라피아(Tilapia mossambica)비늘 효소가수분해물의 생리활성 틸라피아 비늘의 일반성분은 수분함량은 2.6%, 회분함량은 0.3%였고, 조단백질 함량은 97.06%으로 대부분 단백질로 이루어 졌으며, 틸라피아 비늘의 아미노산 조성은 imino acid 조성이 일반건조 20.62%, 원적외선처리 20.62%, 고상발효 20.38%로 보였으며 Gly의 조성은 일반건조 17.25%, 원적외선처리 17.85%, 고상발효 19.76%로 나타났다. 여기서 일반건조와 원적외선처리에 있어 imino acid, Gly의 조성차이는 없었으며, 고상발효시 Gly 함량이 높게 나타났다. 틸라피아 비늘의 열수추출 과정 없이 효소적 가수분해만을 수행한 경우, 3시간부터 12시간까지는 시간 의존적으로 모든 5종의 효소적 가수분해물 (α-chymotrypsin, alcalase, kojizyme, protamex 및 trypsin)의 가수분해도가 증가하였고, 그 뒤에는 거의 유사하거나 다소 감소하는 경향을 보였다. 이 중, alcalase 가수분해물이 12시간까지 다른 효소 가수분해물들보다 다소 높은 가수분해도보였다. 틸라피아 비늘의 열수처리 후, 효소적 가수분해로 제조된 가수분해물들은 높은 가수분해도를 보였으며, 가수분해도는 α-chymotrypsin을 제외하고 6시간까지 급격히 증가하다가 그 이후까지 가수분해도는 일정하게 유지되었다. 하지만, α-chymotrypsin에 의해 제조된 가수분해물은 12시간까지 지속적으로 가수분해도의 증가를 보였으며 12시간 가수분해에서 약 55%의 가장 높은 가수분해도를 보였고, 이는 열수추출 없이 α-chymotrypsin만 처리하여 가수분해도를 측정하였을 때보다 약 15% 가수분해도 증가를 보였다. 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물들이 ACE 저해 활성은 3시간부터 12시간까지 가수분해시간이 증가함에 따라 모든 효소 가수분해물(1㎎/㎖)의 ACE 저해활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 다른 효소에 비하여 α-chymotrypsin와 alcalase를 이용하여 제조된 틸라피아 비늘의 효소적 가수분해물이 약 60%～ 75%의 ACE 저해활성 보였다. 높은 ACE 저해작용을 보인 12시간째 α-chymotrypsin와 alcalase 가수분해물들을 가지고 다양한 농도 (0.25, 0.5 및 1㎎/㎖)에서 농도가 증가함에 따라 ACE 저해활성이 상당히 증가한 것을 확인할 수 있었다. α-chymotrypsin 가수분해물의 IC_(50) 값은 0.7㎎/㎖이었고, alcalase 가수분해물의 IC_(50) 값은 0.83㎎/㎖이었다. α-Chymotrypsin 가수분해물을 가지고 기질 대 효소비를 10, 20, 50, 100, 200, 500(wt/wt)으로하여 가수분해도를 측정한 결과, 기질 대 효소의 비가 증가할수록, 즉 효소의 농도가 감소할수록 가수분해도는 감소하였다. 또한, 틸라피아 비늘 대 효소의 비율이 10(wt/wt)부터 200(wt/wt)까지 증가하면서 가수분해도가 약 65%에서 약 45%까지 급격히 감소하였고, 200(wt/wt)부터 500(wt/wt)까지는 거의 유사한 가수분해도를 보였다. 틸라피아 비늘의 α-chymotrypsin 가수분해물을 100(wt/wt)에서 기질농도를 1%, 3%, 5%, 10%, 20%로 각각 조절하여 다음 실험을 결과 기질의 농도가 낮을수록 가수분해도가 다소 증가하는 하였다. 틸라피아 비늘로부터 α-chymotrypsin를 이용하여 pH 7.8, 25℃, 12hrs, Substrate/Enzyme ratio=100 (wt/wt) 및 Substrate concentration=10%의 조건으로 가수분해 한 경우, 틸라피아 비늘 효소적 가수분해물의 제조를 위한 최적 조건이었다. 틸라피아 비늘 α-chymotrypsin 가수분해물을 가지고 5kDa, 10kDa 및 30kDa의 막을 사용하는 한외여과막 분리 시스템(Ultrafiltration membrane)에 의해 5kDa 이하, 10kDa 이하 및 30kDa 이하 분획물들을 제조하여 3가지 분획물을 가지고 다양한 농도별 (0.25, 0.5 및 1㎎/㎖)로 ACE 저해활성을 측정한 결과, 모든 분획물의 농도가 증가할수록 ACE의 저해 활성이 증가하였다.. 특히, 모든 농도에서 5kDa 이하 분획물의 ACE에 대한 IC_(50) 값이 0.1㎎/㎖로서, 10kDa 및 30kDa 이하 분획물의 IC_(50) 값인 0.31㎎/㎖과 0.7㎎/㎖보다 상당히 높은 ACE 저해 활성을 보였다. 또한, 5kDa 이하 분획물의 농도가 0.25㎎/㎖에서 1㎎/㎖까지 증가하면서, 약 60%의 ACE 저해 활성이 약 89%까지 증가하였다. 틸라피아 비늘의 단백질 가수분해효소(α-chymotrypsin, Alcalase, Kojizyme 및 Trypsin) 추출물의 tyrosinase의 저해활성은 고농도에서도 낮은 tyrosinase저해 활성을 확인하였다. α-chymotrypsin 추출물 50㎎/㎖에서 30.5%, Alcalase 추출물에서 44.6%의 억제 활성을 보여주었다. 이는 화장품 미백기능성 고시원료인 albutin에 비해 현저하게 낮은 활성을 보여주고 있다. 틸라피아 비늘의 단백질 가수분해효소(α-chymotrypsin, alcalase, kojizyme 및 trypsin) 추출물의 elastase 저해활성은 α-chymotrypsin 추출물 50㎎/㎖에서 81.8%, alcalase 74.9%, kojizyme 68.3%, trypsin 77.2%의 억제 활성을 보여주었다. 하지만 이는 화장품 미백기능성 고시원료인 빈랑자(Arecae Semen)추출물 현저하게 낮은 활성을 보이고 있다. 이 연구를 통해 수산가공과정을 거쳐 폐기물로 버려지고 있는 가공부산물인 옥돔 비늘과 더불어 틸라피아 비늘의 젤라틴 및 효소적 가수분해물의 저분자 펩티드가 상당히 우수한 항고혈압 활성을 나타냄으로써, 기능성 식품 소재 및 잠재적인 의약품 소재로서 충분한 연구 가치가 있다고 생각되며 좀 더 체계적인 연구가 이루어져야 할 것이다.

Part 1. Biological activity of enzymatic hydrolysate from Branchiostegus japonicus scale Gelatin derived from collagen has been widely used in food, medicine and photographic industries over the years. However, gelatins from mammalian resource are limited in utility of processing in functional food, cosmetic and pharmaceutical products because frequent occurrences of bovine spongiform encephalopathy(BSE) and foot/mouth diseases(FMD) are to be serious problems for human health. This study includes extraction of gelatin from B. japonicus scale, manufacturing of hydrolysate by means of subcritical water and enzyme, and examination of DH(degree of hydrolysis), antioxidant, antihypertensive, whitening and antiwinkle effects. In order to investigate physicochemical characteristics of B. japonicus scale and gelatin from B. japonicus scale, proximate components, gel strength, gelling point, amino acid composition were measured. This study was conducted to investigate the gelatin hydrolysates processed from B. japonicus scale containing high protein content(about 46.1%) has been the reacitive oxigen species(ROS) scavenging, angiotensin I converting enzyme(ACE) inhibitory activity, tyrosinase inhibitory activity and elastase inhibitory activity were prepared the enzymatic gelatin hydrolysates by four proteases (a-chymotrypsin, alcalase, neutrase and trypsin) from B. japonicus scale gelatin prepared according to different reaction times, substrate/enzyme ratios and substrate concentrations. The gel strength of B. japonicus scale gelatin was lower than commercial gelatin(150 and 200bloom) from tilapia scale, while gelling point were lower. As a result of measuring DH of gelatin hydrolysate by means of four proteases (a-chymotrypsin, alcalase, neutrase and trypsin), it turned out that in reaction of B. japonicus scale gelatin for 6 hrs, DH was 50～65%. As the reaction time of hydrolysis increased, DH increased accordingly. In addition, the values of alcalase hydrolysate were higher than those of other enzymes hydrolysate at the each section. Then, its identified that respective gelatin hydrolysates of neutrase and a-chymotrypsin showed the highest DPPH radical and H2O2 scavenging activities(IC50 value; 9.18㎎/㎖ and 9.74㎎/㎖), but the activities were not significant. its observed that the four gelatin hydrolysates significantly increased ACE inhibitory activities from about 20% to 60% with their hydrolysis degrees. Among them, the alcalase gelatin hydrolysates showed the higher ACE inhibitory activity(IC50 value; 0.73㎎/㎖). Almost all of enzyme hydrolyastes of gelatin from B. japonicus scale showed the inhibitory activities against tyrosinase and elastase. Alcalase hydrolysate showed more than 70% of the inhibitory activity tyrosinase. a-chymotrypsin hydrolysate showed more than 90% of the inhibitory activity elastase. These results suggest that the enzymatic gelatin hydrolysates prepared from B. japonicus scale might have a potential function in ACE, tyrosinase and elastase inhibitory effect. Therefore, B. japonicus scale could be used to industrial application for functional food materials. Part 2. Biological activity of enzymatic hydrolysate from Tilapia mossambica scale Recently, fish scale has been reported as a potential material in functional food industry due to its antioxidant and antihypertensive effects. In this study were investigated the ACE inhibitory activity of tilapia(T. mossambica) scale. Enzymatic hydrolysates of the tilapia scale were prepared by the enzymatic extraction technique using five proteases (a-chymotrypsin, alcalase, kojizyme, protamex and trypsin) after tilapia scale was applied to the hot water extraction for 3hr. its identified that the tilapia scale enzymatic hydrolysates prepared using both hot water and enzymes treatment markedly increased the hydrolysis degree(from about 25% to 55%), comparing to only enzyme treatment(from about 15% to 45%). In addition, the enzymatic hydrolysates(1㎎/㎖) prepared by both hot water and enzymes treatment significantly increased the ACE inhibitory activities from about 20% to 75% and they consisted of their hydrolysis degree. Especially, the alcalase and a-chymotrypsin hydrolysates showed the higher ACE inhibitory activities (IC50 values; 0.83㎎/㎖ and 0.68㎎/㎖, respectively) than the others. In addition, its identified that the ACE inhibitory effects of a-chymotrypsin hydrolysates were increased as decreasing their molecular weights. its also showed that the 5 kDa> fraction has the highest ACE inhibitory activity (about 89.9% and IC50 values; 0.1㎎/㎖) among three fractions (5kDa>, 10kDa> and 30kDa> fractions). There results indicated that its could be suggested that the peptide compounds of enzymatic hydrolysates prepared from tilapia scale induced the ACE inhibitory activities and might be used as the potential antihypertensive materials.