한우 모색 특성 및 무색소증에 대한 분자유전학적 연구

Abstract

본 연구는 우리나라 재래소인 한우와 제주흑우 모색 특성을 설명하고, 한우에서 무색소증 발생에 대한 유전적 기초를 결정하고자 수행하였다. 소에서 모색 출현 양상의 특성을 살펴보기 위해, 모발에서 전체 melanin 함량을 정량적으로 분석하여 소 품종들 간에서 비교하였다. 전체 melanin의 수준은 다양한 소 품종들에서 모발을 수집하여 분광광도분석법으로 측정하였다. 흑모색 품종들 중에서 제주흑우의 전체 melanin 함량은 Holstein과 Angus에 비해 유의적(P<0.001)으로 낮았다. 반면 제주흑우의 전체 melanin 함량 수준은 황갈색 품종인 한우, 적색 품종인 Red Angus와 Red Holstein에 비해서는 유의적(P<0.001)으로 높았다. 또한 황색/적색 계열인 품종들 중에서는 한우의 전체 melanin 함량이 Red Angus와 Red Holstein에 비해 유의적(P<0.001)으로 낮았고, 한우×Charolais 사이에서 생산된 미황색 교배 잡종들에 비해서는 유의적(P<0.001)으로 높은 수준을 나타내었다. 흑모색 Angus와 제주흑우, Red Holstein과 한우에서 pheomelanin에 대한 eumelanin의 상대 비는 각각 0.382, 0.359, 0.112, 0.124로 확인되었다. 이러한 결과들은 전체 melanin 함량과 eumelanin의 수준이 높은 소들이 피부에서 흑색 외피가 발생하고 전체 melanin 함량과 eumelanin 수준이 낮으면 황색/적색 외피가 발생함을 나타내어, 소의 모발과 모색 양상들이 전체 melanin과 eumelanin의 수준에 따라 결정된다는 것을 제안하고 있다. 모색 출현 양상과 유전자 발현의 상관관계를 밝히기 위해, 색소세포 내에서 melanin 생합성에 결정적인 역할들을 수행하는 Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), and Dopachrome tautomerase (DCT) 세 유전자의 발현 양상을 반정량적 real time RT-PCR 기법으로 분석하였다. 세 유전자의 발현 수준에 대한 조사는 사전에 조사된 MC1R 유전자형에 따라 4 가지 대표적인 모색 부위 - MC1R e/e 한우의 황갈색, E+/E+ 제주흑우의 야생형 흑모색, ED/ED Holstein 우성 흑모색 부위와 백반 부위를 대상으로 수행하였다. Holstein 흑반에서 TYR, TYRP1, DCT의 발현 수준은 제주흑우에 비해 각각 4.5, 2.3, 2.5배 이상 유의적(P<0.001)으로 높았다. 또한, 제주흑우에서 이들 세 유전자의 발현 수준은 한우보다 유의적(P<0.001)으로 높았다. 이러한 결과들은 한우, 제주흑우, Holstein에서 모색 표현형이 TYR, TYRP1, DCT의 전사 수준과 직접적인 상관관계가 있음을 보여주고 있다. 게다가, 이들 유전자의 발현 수준은 품종별로 대표적인 한우(e/e), 제주흑우(E+/E+), Holstein(ED/ED)의 대표적인 MC1R 유전자형 분포와 부합된 결과를 나타내었다. 이상의 결과들은 MC1R 유전자형이 소 피부에서 전체 melanin 함량을 결정하고 melanin 생합성을 책임지는 TYR과 하위 유전자들의 전사활성을 유도함을 나타내었다. 한우와 제주흑우에서 TYR과 TYRP1의 상보적 DNA 전체 서열을 결정하였다. 기존에 다른 품종들에서 보고된 서열들과 비교했을 때, TYR cDNA의 전체 암호화 서열들은 차이점이 없었다. 반면, 한우뿐만 아니라 제주흑우의 일부에서 몇 개의 exon들이 결실되어 형성된 짧은 변이 전사체가 새롭게 발견되었다. 이러한 발견에 기초하여 소에서 이 변이형 전사체와 모색 출현 양상의 상호관계에 대한 심층적인 연구가 요구되었다. 최근 우리나라 한우 농장들에서 백모색 송아지들이 보고되었다. 전체 9 두의 흰색 송아지들이 전라북도와 충청남도의 3 한우 농장에서 발견되었다. 가계 분석과 유전학적 조사를 위해 각각의 농장에서 해당 백색 송아지와 이들과 혈연관계가 높은 황갈색 한우 개체들을 수집하였다. 피부, 모발, 안구의 색에 대한 관찰 소견을 바탕으로 송아지들은 안피부무색소증(OCA)에 의해 발생한 무색소증으로, 이는 소 품종 중 전신 백색이 품종의 특징인 Charolais와 연관되지 않은 것으로 확인되었다. 송아지들은 눈과 피부를 포함한 모든 색소발생기관에서 melanin성 색소들을 결핍되어 있었다. 또한, 이들은 다른 포유동물의 OCA와 같은 상동염색체성 열성유전양상을 나타내었다. 무색소증 한우의 모발은 Holstein의 백반을 포함하여 조사에 이용된 모든 소 품종 중에서 가장 낮은 전체 melanin 함량을 나타내었다. 색소세포 특이 항원들을 이용한 조직면역화학 염색 분석 결과는 무색소증 한우 귀 피부에 색소세포가 존재한다는 증거를 제공하였다. 또한 색소세포 표지인자들을 이용한 flowcytometry 분석과 면역형광 염색 분석에서도 무색소증 한우에서 색소세포의 존재에 대한 조직학적 증거들을 추가로 확인하였다. 무색소증 한우와 이들과 혈연관계인 15 두의 DNA 시료들을 수집하여 포유류에서 강력한 후보 유전자들로 알려진 SILV와 TYR 유전자에 대한 무색소증의 발생에 대한 원인 돌연변이 검출에 이용하였다. 염기서열 분석 결과 TYR 유전자의 c.871G>A가 무색소증-특이 돌연변이로 확인되었으나 SILV 유전자에서는 전혀 특이할만한 염기변이가 없었다. 모든 무색소증 한우들은 TYR c.871A/A (C 유전자 좌위 인자형 c/c), 이들의 황갈색 어미소들과 형제-자매들은 모두 이형접합성인 TYR c.871A/G (C/c)를 나타내었다. 반면, 무색소증과 혈연관계가 없는 모든 한우 개체들은 동형접합성 TYR c.871G/G (C/C)를 나타내었다. TYR c.871G>A 돌연변이에 대한 유전자형 분포는 한우에서 무색소증 유전양상과 정확히 일치하였다. 집단유전학적 분석에 이용한 모든 DNA 시료들 중에서 단지 1 개체의 DNA에서만 TYR c.871G/A 이형접합자로 확인되었다. 하지만, 해당 개체가 품종식별이 되지 않은 채 도축된 개체여서 품종확인은 불가능하였다. 소 품종들에서 각각의 모색에 대한 가계도 분석과 유전자형 분석의 결과들은 TYR c.871G>A 돌연변이가 한우에서 무색소증 개체와 보인자들을 검출하는 진단 분자표지인자가 될 수 있음을 보여주었다. 결론적으로, 소의 모색들은 주로 MSH 신호전달에 대한 1 차 반응 유전자인 MC1R, 색소세포 내에서 melanin 생합성을 담당하는 TYR, TYRP1, DCT 등의 유전자형을 유전적 배경으로 하여 조절되고 있다. 또한, 최근 우리나라에서 발생한 무색소증 한우들은 TYR 유전자의 돌연변이가 원인인 것으로 확인되었다. 본 연구의 결과들은 우리나라 재래 소 품종인 한우와 제주흑우의 품종식별체계와 모색 유전학에 대한 과학적 기초를 제공할 수 있을 것이다. 본 연구를 통해서 정립된 새로운 연구기법들은 모색 양상의 결정, melanin 함량의 측정, 무색소증 한우 및 보인자의 검출뿐만 아니라 우리나라 소 산업에서 분자육종을 가속화하는 데 기여할 것으로 사료된다.

This study was carried out to explain coat color characteristics in native Korean cattle, Hanwoo, and Jeju Black cattle (JBC). Our study also determined the genetic basis of the occurrence of albinos in Hanwoo. Melanin contents in hairs were quantitatively assayed and compared among cattle breeds to characterize the coat color patterns in cattle. Spectrophotometric assay was used to measure total melanin levels of upper scapular hairs that were obtained from various cattle breeds. The total melanin content of JBC was significantly lower than those of Holstein and Angus (P<0.001) among breeds with black coats. Total melanin content of JBC was significantly higher than that of Hanwoo, a breed with a yellowish-brown coat, and the red-coated breeds, Red Angus and Red Holstein, respectively (P<0.001). In addition, among yellow/red-coated breeds, total melanin content of Hanwoo was significantly lower than that of Red Angus and Red Holstein, but higher than that of crossbred animals exhibiting a pale yellow coat produced from a cross of Hanwoo and Charolais (P<0.001). The relative ratios of eumelanin to pheomelanin in black-colored Angus, JBC, Red Holstein, and Hanwoo were 0.382, 0.359, 0.112 and 0.124, respectively. These results indicated that cattle with higher total melanin and eumelanin levels developed a black coat while those with lower total melanin and eumelanin levels developed a yellow/red coat, suggesting that bovine hair and coat color patterns may be determined by their total melanin and eumelanin levels. In order to reveal the relation of coat color pattern and gene expression, the expression levels of three genes which play a critical role in melanin synthesis in melanocytes, Tyrosinase (TYR), Tyrosinase-related protein 1 (TYRP1), and Dopachrome tautomerase (DCT), were analyzed by a semi-quantitative real time reverse transcription-PCR (RT-PCR) technique. An investigation into the expression levels of these three genes was conducted based upon the genotypes of the Melanocortin 1 receptor(MC1R) gene which was preliminarily determined in the four representative coat colors - yellowish-brown from MC1R e/e in Hanwoo, wild type black from E+/E+ in JBC, and dominant black and white pied regions from ED/ED in Holstein. In Holstein black skin, the expression levels of TYR, TYRP1, and DCT were over 4.5, 2.3, and 2.5 folds higher than those of JBC, respectively (P<0.001). The expression levels of these three genes in JBC were significantly higher than those of Hanwoo (P<0.001). Our results indicate that coat color phenotypes in Hanwoo, JBC and Holstein breeds are directly correlated with the TRY, TYRP1, and DCT in transcription levels. Moreover, these gene expression levels also coincide with the genotypic distribution of the MC1R gene - e/e in Hanwoo, E+/E+ in JBC and ED/ED in Holstein. These results infer that the MC1R genotypes may determine the levels of total melanin content in the skin of Hanwoo and JBC as well as induce transcription activities of a TYR series and its downstream genes responsible for melanin synthesis. The entire complementary DNA (cDNA) sequences of TYR and TYRP1 were determined in Hanwoo and JBC. In comparison to those previously reported in cattle breeds, no differences were found in the complete coding sequences of TYR cDNAs. However, a novel short transcription variant showing the deletion of several exons was detected in TYRP1 in part of Hanwoo as well as in JBC. Based on this finding, further studies are recommended on the correlation between this transcription variant and coat color pattern in cattle. Recently, white coat calves with white coats have been reported on Hanwoo farms in South Korea. A total of 9 white individuals were found on three Hanwoo farms in Jeollabuk-do and Chungcheongnam-do. These calves and their yellowish-brown Hanwoo relatives were collected from each farm for pedigree analysis and genetic investigation. Based on the observation of the color of skin, hair, and eyes, the calves were identified as albinos due to oculocutaneous albinism (OCA) which differs from the Charolais-related white coat color, a specific characteristic of the Charolais breed. The calves lacked melanogenic pigments in whole pigmentary organs including eyes and skin. In addition, they displayed the autosomal recessive inheritance patterns identical to OCA in mammals. Albino hair showed the lowest level of melanin content among the cattle breeds tested including the white pied region of Holstein. The evidence for the existence of melanocytes in ear skin was provided from the results of the immunohistochemical (IHC) staining for melanocytes using melanocyte specific antigen analysis. Further results obtained from flow cytometry and immunofluorescent staining using melanocyte cell markers have given histological evidence for the existence of melanocytes in albinos. A total of 15 DNA samples of the albinos and their relatives were collected and used to screen for causative mutation for the development of albinism in SILV and TYR genes, known as critical candidate genes in mammals. DNA sequencing results showed the albino-specific mutation c.871G>A in TYR, but not in SILV. All albinos had the homozygous TYR c.871A/A and their dams and relatives with yellow coats had the heterozygous TYR c.871A/G. However, all Hanwoo individuals unrelated to the albinos had the homozygous TYR c.871G/G. The genotypic distribution of the mutation TYR c.871G>A was consistent with the bovine inheritance patterns of albinism in Hanwoo. Out of all DNA samples tested for the other population study, only one individual was heterozygous TYR c.871G/A. However, its breed was not identified because it was slaughtered as an unidentified crossbreed. The pedigree and genotypic analyses results for each coat color in the different cattle breeds suggested that this TYR c.871G>A mutation may be a diagnostic molecular marker for detection of albinos and their carriers in Hanwoo. In conclusion, bovine coat colors are mainly regulated by the genetic backgrounds of genotypes of the primary response gene for MSH signaling, MC1R, and the melanocyte intracellular melanin synthesis genes, TYR, TYRP1, and DCT. In addition, the Hanwoo albinos recently found in Korea were caused by a mutation of the TYR gene. The results of this study will provide the scientific basis of coat color genetics and a breed identification system for the Korean cattle breeds, Hanwoo and JBC. The newly established molecular methods developed in this study have also contributed to determining hair color patterns, measuring for melanin contents, detecting albinos and their carriers, and accelerating molecular breeding in the cattle industry in Korea.