체외 생산된 배아로부터 소배아줄기세포주 확립

Abstract

소 배아줄기세포는 농업과 의료 분야 응용에 강력한 도구가 될 수 있다. 본 연구는 소 배아줄기세포 확립 조건을 적정화하고 확립된 줄기세포의 pluripotency 특성을 조사하기 위해 실시하였다. 체외에서 생산된 총 126개의 배반포기배를 발달단계와 내부세포괴 (ICM) 크기로 구분하여 공시하였을 때, 초기 소 줄기세포-유사 콜로니 형성은 21개 (16.7%) 였으며, 이로부터 12 계대 이상 (>90 일) 유지된 6개의 소 배아줄기세포주가 확립되었다 (28.6%, 6/21; 부화배반포기배 x 4, 부화진행배반포기배 x 1, 팽창배반포기배 x 1). 중간 크기 이상의 내부세포괴를 가진 부화배반포기배로부터 ICM을 기계적으로 제거한 뒤, 10ul 드롭으로 제작된 생쥐배아지지세포 (MEF) 위에 옮겨 오일로 피복하여 배양하였을 때, 소 배아줄기세포 성장이 용이하다는 것을 확인하였다. 이들 세포는 전형적인 배아줄기세포의 형태를 보이며 면역세포화학염색법, RT-PCR과 real-time RT-PCR로 조사하였을 때, Oct4, stagespecific embryonic antigens 1, Nanog, Tumor rejection antigen-1-81, Rex1 and alkaline phosphatase 와 같은 pluripotency 마커가 발현되는 것 을 확인하였다. 또한, 자발적 분화에서 조사된 삼배엽 분화 특성 마커, 즉외배엽 (Pax6 and DBH), 중배엽 (CMP and Enolase) 내배엽(a-FP andalbumin) 모두 발현되는 것을 공히 확인하였다. 더불어 신경유도분화에서도 신경세포 마커 (Map2 and Tuj1) 와 신경보조세포 마커 (GFAP) 를 확인할 수 있었다. 핵형분석 결과, JNU-ibES-05세포주는 60개의 역색체 (58+XY) 로 정상임을 확인하였다. 따라서, 소 배아줄기세포주는 체외에서 생산된 건강한 부화배반포기배를 이용하여 본 연구팀이 개발한 적정화된 배아줄기세포 배양환경하에서 효율적으로 확립될 수 있음을 나타낸다.

Bovine embryonic stem (ES) cells are powerful tool for the agricultural and biomedical applications, and the aim of this study was to optimize the generation condition of bovine ES cells and to determine their plutipotency chatacteristics. From total 126 blastocysts produced in vitro, classified by their development stage and ICM size, 21 primary bovine ES cell-like colonies were formed (16.7%) and established 6 bovine ES cell lines (28.6%, 6/21; Hatched x 4, Hatching x 1 and expanded x 1) maintained for more than 12 passage (> 90 days). Mechanically isolated over medium sized ICM of hatched blastocyst has high potency to form into ES cell growth on the 10 ul mouse embryonic feeder cell drop covered with oil. These cells exhibit typical ES cell morphology and express pluripotency markers through the immunocytochemistry, RT-PCR and real-time RT-PCR, including Oct4, stage-specific embryonic antigens 1, Nanog, Tumor rejection antigen-1-81, Rex1 and alkaline phosphatase.Also, RT-PCR results demonstrated expression of genes representative of the three embryonic germ layers ectodermal (Pax6 and DBH), mesodermal (CMP and Enolase) endodermal (a-FP and albumin) markers in spontaneous differentiation. In addition, bovine ES cell lines were directed differentiated easily into neuronal (Map2 and Tuj1) and atrial cells (GFAP). Bovine ES cell lines had normal karyotype having a chromosome count of 58+XY (JNU-ibES-05). This result demonstrated that bovine ES cell line can be efficiently established using healthy hatched blastocysts produced in vitro in the our designed optimized bovine ES cell culture condition.