포도의 CYP74 family 유전자 cloning 및 재조합 단백질의 발현과 특성 분석

Abstract

포도에서 옥시리핀 생합성 관련 유전자를 선발하고 그 기능을 확인하고자 포도의 CYP74 family 유전자를 선발하였다. 포도에서 분리한 VvCYP74 유전자는 open reading frame의 길이가 1452bp 였으며, 483개의 아미노산을 코드하는 것으로 확인되었고, 상동성조사 및 계통분석 등을 통하여 선발한 유전자는 CYP74C subfamily에 속할 가능성이 높은 것을 확인하였다. 이 유전자의 기능을 확인하고자 선발한 유전자를 대장균 발현벡터인 pCWori+에 재구성 한 후 대장균에서 발현하여 재조합단백질을 분리/정제 하였으며, 그 기능을 효소활성분석을 통하여 확인한 결과, oxylipin 생합성에 중요한 역할을 하는 AOS인 것으로 확인되었다. 옥시리핀 생합성 효소인 AOS/HPL의 활성에는 N-terminus 부근의 phenylalanine/leucine 역할이 매우 중요한 것으로 알려져 있어 이 아미노산 잔기의 변화와 활성과의 관련성을 확인하고자 포도에서 선발한 VvCYP74 유전자의 100번째 아미노산 잔기 phenylalanine을 leucine으로 치환하였다. 그리고 그 유전자를 대장균에서 발현시켜 재조합단백질 분리/정제한 후 효소활성을 분석하여 본 결과, 기대했던 바와 같이 HPL 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 이와 더불어 EAS 활성도 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때 옥시리핀 생합성효소인 AOS와 HPL의 활성에는 N-terminus 부근의 phenylalanine/leucine의 역할이 매우 중요하다는 것을 확인하였다. 결론적으로, 본 연구를 통하여 포도에서 옥시리핀 생합성 관련 유전자(VvCYP74C)를 선발하였고, 그 기능을 확인한 결과 AOS 활성이 있는 것으로 확인되었다. 이 유전자의 100번째 아미노산 잔기 phenylalanine을 leucine으로 치환하여 기능을 분석하여 본 결과, 기능이 AOS에서 HPL로 변화하는 것을 확인하였으며, 이와 더불어 EAS활성도 보이는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 향후 포도의 병해충저항성을 증진하는 분자생물학적 연구에 있어 매우 중요한 기반이 될 것으로 사료된다.

In order to identify gene function related to oxylipin biosynthesis, cytochrome P450 (CYP450) 74 family gene was isolated from grape, Vitis vinifera L. The length of this gene was 1,452 bp in nucleotide sequences, which encoded 479 amino acids. Through bioinformatic analysis such as identification of special domains and motifs observed in typical CYP450, homology search with BlastX program against NCBI database and phylogenetic analysis, we assumed that cloned gene might be CYP74C subfamily, which was known to show allene oxide synthase (AOS) or hydroperoxide lyase (HPL) activity in the oxylipin biosynthesis. Recombinant protein encoded by cloned gene was expressed in E. coli using pCWori+ vector, and purified using Ni2+-NTA column chromatography and gel filtration. This protein showed about 55 kDa in molecular weight as expected, and AOS activity resulting in final product, α- and γ- ketol from 9(S)-hydroperoxy-10(E),12(Z)-octadecadienoic acid (9-HPOD) or 13(S)-hydroperoxy-9(Z),11(E)-octadecadienoic acid (13-HPOD) substrates in the activity assay. However, it was appeared that this protein preferred more 9-HPOD than 13-HPOD as a substrate. This result indicated that purified protein might be 9-AOS in the oxylipin biosynthesis. To identify activity swapping after changing specific residue conserved differently in AOS and HPL, phenylalanine at 100 residue (Phe100) of wild-type CYP74C was changed to leucine, and recombinant protein was expressed and purified using same condition with wild-type. Then, protein activity was measured with 9-HPOD and 13-HPOD substrates. As the result, this protein produced 9-oxononanoic acid and 12-oxo-9(Z)-dodecenoic acid, which were known as a metabolites synthesized by HPL. In addition, 11-hydroxy-9, 10-epoxy-12(Z)-octadecenoic acid and 11-hydroxy-12, 13-epoxy-9(Z)-octadecenoic acid which were known as a product synthesized by epoxy alcohol synthase (EAS) enzyme in the oxylipin biosynthesis, were also detected. Those result indicated that phenylalanine/leucine residue may be very important to the activity of CYP74 because point-mutated CYP74C has a HPL and EAS activity in the oxylipin biosynthesis.