한라봉으로부터 글루코실트랜스퍼레이즈의 분자 클로닝

Abstract

The glycosylation of flavonoids is an essential modification contributing to the complexity of secondary metabolites and is often the last step in the biosynthesis of natural compound, affecting water solubility and stability of flavonoids. Glucosyltransferase (GT) are member of glycosyltransferases and transfer glucose to an acceptor molecule. In this study, ten novel GT genes were cloned and characterized from Citrus reticulata cv. Siranui. These genes are named as GT150, GT1669, GT259, GT285, GT173, GT2282, GT3363, GT3591, CiGT1, and CiGT2, respectively. Eight GT genes (GT150, GT1669, GT259, GT285, GT173, GT2282, GT3363, and GT3591) were amplified from first-strand cDNA that synthesized from total RNA of C. reticulata leaves by using Polymerase chain reaction (PCR) with gene specific primers. CiGT1 and CiGT2 gene were amplified by using reverse transcription (RT) - PCR with gene specific primers. The full-length GT cDNAs were cloned and expressed as glutathione S-transferase fusion proteins, and then, their activities were assayed with naringenin and quercetin, which are typical substrates for the enzyme producing flavonoid 7-O-glucoside and flavonoid 3-O- glucoside, respectively. Based on HPLC analysis, GT173, GT285, and GT3363 gene products showed GT activities on naringenin and quercetin, demonstrating these genes were both related flavonoid 7-O-glucoside and flavonoid 3-O- glucoside. Compared to GT285 and GT3363, GT173 showed only a detectable activity on naringenin. GT2282 and GT3591 were determined to glucosylate naringenin, producing its 7-O-glucoside. Interestingly, GT259 can glucosylate quercetin but its modification was not 3-O site, suggesting the other site could be glucosylated. On the other hand, GT150, GT1669, CiGT1, and CiGT2 did not transfer glucose to two flavonoid substrates in this study. For these four genes, further study need to identify their substrate.

플라보노이드의 글라이코실레이션은 이차 대사물질의 복잡성에 관여하는 필수적인 변환과정이고 천연물 생합성의 마지막 단계에서 발생하며, 플라보노이드의 안정성과 수용성에 영향을 끼친다. 글루코실트렌스퍼라아제는 글리코실트렌스퍼라아제의 한 멤버이고 글루코스를 수용체에 운반한다. 본 연구에서는, 한라봉으로부터 10개의 글루코실트렌스퍼라아제 유전자, GT150, GT1669, GT259, GT285, GT173, GT2282, GT3363, GT3591, CiGT1, and CiGT, 를 동정하였다. 한라봉에서 추출한 total RNA로부터 싱글 cDNA를 합성 후, 유전자 특이 프라이머와 PCR을 이용하여 8개의 유전자 (GT150, GT1669, GT259, GT285, GT173, GT2282, GT3363, and GT3591)를 분리하였다. CiGT1과 CiGT2는 reverse transcription (RT)-PCR을 이용하여 분리하였다. 완전장 GT cDNA는 클로닝 하였고, GST 재조합 단백질을 합성하여 발현시켰으며, 이 재조합 단백질들의 효소활성은 플라보노이드7-O-글리코사이드와 플라보노이드3-O-글리코사이드를 생산하는 전형적인 기질인 naringenin과 quercetin을 이용하여 분석하였다. HPLC분석에 의하면, GT173, 285와 3363은 naringenin과 quercetin에서 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 각각의 반응 산물의 구조는 7-O-glucoside와 3-O-glucoside와 관련이 있다는 것을 확인하였다. GT285는 GT3363과 GT173에 비해 naringenin의 활성이 약하게 나타났고, GT3591과 GT2282는 naringenin-7-O-glucoside와 관련이 있는 것을 확인하였다. 본 연구 결과에서 GT259는 흥미롭게도 quercetin을 기질로 하였을 때 3-O-glucoside가 아닌 다른 생산물을 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, GT150, 1669, CiGT1, 그리고 CiGT2는 naringenin과 quercetin 기질에 활성이 없음을 확인하였다. 이러한 결과들은 한라봉에서 분리한 각각의 GT 유전자들이 기질 특이성을 갖는다는 것을 보여주는 결과이다. 본 연구 결과를 기초로 추후에는 활성을 보이지 않은 GT150, 1669, CiGT1, 그리고 CiGT2에 대해 kaempferol, anthocyanin 그리고 hesperidin과 같은 기질을 이용하여 플라보노이드 분석을 할 예정이다. 이러한 결과들은 앞으로 당합성 관련 유용 유전자의 유전정보 확보를 통한 생리 및 물질대사 기능 분석등의 결과 도출과 나아가 감귤 분자육종 및 고품질 감귤생산의 기반을 확립하는데 큰 도움이 될 것이다.