Isolation of cellulolytic Bacillus species indigenous to Jeju Island, comparison of their cellulase genes and application to cucumber seedling growth

Abstract

본 연구는 제주지역에 서식하고 있는 유용한 미생물자원 중에서 섬유소 분해 효소 생산능이 우수한 균주를 개발하기 위하여 수행되었다. 섬유소는 식물 세포벽을 구성하고 있는 주요성분으로 자연계에 널리 분포하고 있는 중요한 자원이며, 섬유소의 분해는 지구상에서 탄소의 순환 등 물질순환에 매우 중요한 위치를 차지하고 있다. 그리고 섬유소를 분해하는 효소는 대부분 미생물에 위해 생산된다. 본 연구에서는 토양, 퇴비 그리고 가축분뇨 등에서 섬유소 분해효소를 생산하는 균주를 탐색하고 848 균주를 분리하였다. 그리고 각각의 분리원에서 섬유소 분해효소 생산능이 가장 우수한 균주인 SL9-9, C5-16, 그리고 S52-2 등 3종을 선발하였다. 최종 선발한 3종의 균주는 형태학적, 생리?생화학적 특성 그리고 16S rRNA를 분석한 결과 모두 Bacillus subtilis로 동정되었다. 그리고 선발한 B. subtilis SL9-9, C5-16 그리고 S52-2 균주의 섬유소 분해에 관여하는 여러가지 효소의 생산 특성을 조사하였다. 선발한 3종 모두 섬유소 분해에 관여하는 효소인 endoglucanase (carboxymethylcelluase, CMCase), exoglucanase (avicelase), 그리고 β-glucosidase 효소를 생산하였으며, 이중에서 endoglucanase 활성이 가장 높았다. SL9-9 및 S52-2 균주는 hemicellulose를 분해하는 효소인 xylanase 생산능도 우수하였다. 그리고 CMCase, avicelase 그리고 xylanase 효소의 활성은 배양 상등액에서 그리고 β-glucosidase 효소의 활성은 균체내에서 검출되어, CMCase, avicelase 그리고 xylanase는 세포외 효소, β-glucosidase는 세포내 효소임을 확인하였다. 또한 선발한 3종의 Bacillus 균주가 생산하는 CMCase의 효소학적 특성을 조사하였는데, B. subtilis SL9-9, S52-2 균주의 CMCase는 pH 5 및 온도 60℃에서 최적 활성을 보였으며, B. subtilis C5-16 균주의 CMCase는 pH 5 및 온도 50℃에서 최적의 활성을 보였다. 선발한 Bacillus 균주 3종의 섬유소 분해효소 생산능을 높이기 위한 배양조건을 선발하였다. 최적 배양조건은 탄소원, 1% CMC, 질소원, 0.4% soytone 및 0.4% yeast extract, 배지 pH, 5.0, 배양온도, 30～35℃, 회전속도, 150 rpm, 그리고 공기압은 1vvm이었다. 그리고 섬유소 분해효소 대량생산 비용을 줄이기 위하여 여러 가지 농산부산물의 이용 가능성을 검토하였는데, 미강을 이용하였을때 CMCase 활성이 12～13% 증가하여 선발 Bacillus 균주의 대량배양을 위한 탄소원으로 선발하였다. 분리원이 다른 환경조건에서 선발한 3종의 Bacillus 균주는 섬유소 분해효소 활성에서도 균주간 차이를 보였는데, 이러한 차이를 유전학적으로 비교 검토하기 위하여 섬유소 분해효소 생합성 유전자를 분리하고 동정하였다. B. subtilis 균주 3종의 cellulase 생합성에 관여하는 유전자가 클로닝되었으며, 그들의 염기 및 아미노산 서열을 분석한 결과 B. subtilis endo-β-1,4-glucanase 유전자와 99%의 유사성을 보였다. 그리고 선발 균주간에는 93% ～ 96% 정도의 유사성을 보였다. 그리고 분리한 B. subtilis 균주의 cellulase 생합성 유전자의 아미노산 서열을 이미 보고되어 있는 다른 B. subtilis 균주의 유전자와 비교 분석하여 유전자의 특성을 파악하였는데, 분리한 B. subtilis 균주의 cellulase 생합성 유전자는 3개의 domain으로 구성되어 있었으며, catalytic domain (CD)은 glucosyl hydrorase family 5/A2 그룹으로, cellulose-binding domain (CBD)는 family Ⅲa로 분류되었고 그리고 domain을 연결하고 있는 linker 부분으로 구분되었다. 선발한 Bacillus 균주 중에서 다양한 효소활성을 보이며 pH에 안정하고 제제화가 용이한 B. subtilis SL9-9 균주 1종을 최종 선발하고 미생물비료로서 농업적 이용가능성을 검토하였다. B. subtilis SL9-9 균주가 첨가된 유기상토 개발을 위하여 화학비료 대신 영양원으로 유기성 액비를 첨가하여 시험을 수행하였는데, B. subtilis SL9-9 균주의 첨가로 지상부 및 지하부 건물중 그리고 엽면적이 무처리구 대비각각 79%, 71% 및 108% 증가하고 상토의 비옥도 또한 증가함을 확인하였다. 또한 선발한 Bacillus 균주는 섬유소 분해효소를 생산할 뿐만아니라 작물생육촉진과 관련된 질소고정, 인산가용화, 그리고 항균활성 등 다양한 농업적 기능성을 보유하고 있는 것으로 나타났다. 따라서 본 논문에서는 지속가능한 농업을 실현하기 위한 작물 및 토양관리를 위해 섬유소 분해효소를 생산하는 Bacillus 균주의 미생물비료로서의 농업적 적용 가능성을 제시한다.