멸종조류 복원을 위한 꿩 (Phasianus colchicus) 정원줄기세포주 확립 연구

Abstract

동물은 종마다 특이적인 생리적 또는 유전적 특징을 가지고 있다. 이러한 특징들은 이종간 키메라 (chimera)를 활용한 생명과학분야에서 체세포 및 생식세포 분화, 성특이적인 유전자의 발현 분석, 유전자원 보존 등에 폭넓게 활용될 수 있다. 또한 이종간 생식선 키메라의 매우 중요한 가치 중의 하나는 멸종 위기 동물의 복원을 가능하게 한다는 것이다. 포유류에서도 이미 멸종된 동물을 복원하기 위한 연구가 진행되고 있으나 긴 세대기간 때문에 연구에 많은 어려움을 겪고 있다. 조류는 포유류와는 달리 독특한 생식·생리적 특징을 가지고 있으며 포유류에 비해 상대적으로 세대기간이 짧다는 장점이 있다. 꿩은 야생조류로서 야생성이 높고 계절번식을 하지만 개체가 풍부하고 사육이 가능한 조류품종으로 향후 멸종조류 연구의 가장 좋은 실험동물이 될 것으로 사료된다. 본 연구에서는 정원줄기세포를 이용하여 멸종 조류 복원을 위한 기술을 개발 하는데 연구 목적이 있으며 멸종 조류 연구의 동물모델로서 유용성이 기대되는 꿩을 대상으로 꿩 정원줄기세포주 확립에 관한 연구를 수행하였다. 먼저 꿩의 정소를 외과적인 방법으로 회수한 후 정원줄기세포를 추출하였고 닭의 정원줄기세포 배양 조건을 이용하여 STO 기저세포와 꿩의 체세포 공배양 조건에 의한 꿩의 정원줄기세포 증식 조건을 확립하였으며, 결과적으로 공배양을 진행한 상태에서 세포가 증식됨을 확인할 수 있었다. 본 연구에서는 세포주 확립을 위한 계대배양을 진행하였으며 계속적인 계대배양을 거치면서 콜로니는 안정적으로 분열과 증식이 진행하여 세포주 형성에는 긍정적인 방향으로 배양이 진행됨을 확인하였다. 다음으로, 꿩 정원줄기세포에서 특이적인 발현이 예상되는 마커들을 검증한 결과 Oct4, Nanog, Thy1, SSEA-1, SSEA-4 등은 사용된 마커에 반응하는 강도가 매우 낮거나 반응하지 않았지만 GFRa1의 마커에는 반응하는 것이 관찰되었다. GFRa1은 GDNF 계열의 단백질로 정원줄기세포의 증식인자와도 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 수용체 닭의 정소를 불임으로 유도하기 위하여 실험구를 정하고 41 ℃에서 가온한 busulfan을 4주령부터 시작하여 16주령까지 2주 간격으로 주입하여 성성숙 이후에 불임효율을 측정하여 가장 이상적인 불임 효율을 얻을 수 있는 수용체 닭의 조건을 확립하였다. 너무 어린 주령의 경우에는 4주, 6주까지는 약 40 % 정도에 서 불임을 유도하였으나 8주부터는 10주의 경우만 빼고 평균 70 % 이상 불임율을 보이는 것으로 보아 결과가 유의적으로 나타났다 (P ＜ 0.05). 꿩을 이용한 세포 주입은 8주령의 수용체 닭을 사용할 경우 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 이 연구 결과를 좀 더 확인하기 위해 실험이 끝난 닭의 성세포 회복율을 측정하였다. 결과적으로 8주 이후의 성세포의 경우 5 % 이내로 회복하는 것으로 만일 꿩세포가 보다 정상적으로 안착한다면 매우 높은 효율의 키메라를 생산하는 데에는 큰 문제가 없을 것으로 생각된다. 효율적인 정원줄기세포의 대량배양을 위하여 c-kit을 이용하여 92.87 % 분리한 후 세포 배양을 실시하였다. 비분리된 세포와 함께 서로 배양능력을 검증해 본 결과 매우 유의적인 차이를 나타냈고 c-kit 마커가 꿩의 정원줄기세포 분리마커로 사용할 수 있는 가능성을 보여 준 결과라 생각된다. 꿩의 정원줄기세포를 직접 배자에 이식하여 닭의 초기배자 내에서의 절편 발달 유무를 측정하였다. 공여체인 꿩의 성세포의 주입량에 따라 전체 세포군에서 공여체 세포의 비율이 증가함을 확인할 수 있었으며, 전체 세포 중 꿩세포의 분포가 높다는 것을 알 수 있었다. 마지막으로, 꿩의 정원줄기세포를 배자내 이식을 통하여 키메라 생성을 시도하였다. 배 발생율은 낮았지만 초기 생존율이 그리 낮지 않아서 공여세포인 꿩의 성세포에 PKH-26으로 염색을 하여 미세주입한 후 원시생식기로 이동하는 공여체 성세포의 비율을 측정한 결과 30 %의 수용체 닭의 gonad에서 공여체 세포를 관찰 할 수 있었다. 그리고 공여체 세포비율은 낮았지만 줄기세포 비율이 높다면 효율적인 키메라를 생산할 수 있다고 생각했다. 이식한 성세포 중에서 줄기세포 분포를 확인하기 위하여 FACS 방법을 통한 줄기세포능을 지니고 있는 꿩 세포의 분포를 분석한 결과 약 9.48 %의 비율로 c-kit/CD117 양성 세포가 분석되었는데 예상했던 것보다 높은 비율로 안정적으로 수용체의 gonad에 정착되어 있음을 확인할 수 있었다. 지금까지의 연구결과를 볼 때 꿩과 멸종 위기 조류 정원줄기세포주 및 이를 이용한 증식 기술과 불임유도와 같은 수용체 시스템 구축 및 이식세포의 증식, 생존 능력 향상 기술을 개발한다면 효율적인 조류의 이종간 키메라의 생산 기술 개발이 가능할 것이며 이를 정원줄기세포 응용 멸종 위기 조류를 복원하는데 이용 할 수 있을 것이다. 결론적으로 정원줄기세포는 멸종조류의 보존 및 생식선 키메라 생산에 유용한 도구임을 확인하였고 효율적인 조류의 이종간 생식선 키메라의 생산을 위하여 추가적인 연구가 필요하며 안정적인 공급 체계와 시스템이 갖추어 진다면 멸종 조류 복원에도 적용해 볼 수 있다고 생각된다.

Animals have a genetic physiological characterization which is specific for each species. These features can be widely used for differentiation of germ and somatic cells, expression analysis of genes which are specific for a particular sex, and for the conversation of genetic resources in the life sciences that utilize cross-species chimeras. In addition, to this inter-species germline chimeras are important as they allow the restoration of endangered species. Studies for restoring mammalian animals is underway, and the major difficulties are because of long generation interval. Birds, unlike mammals, have reproductive and physiological characterization, and have the advantage that the generation interval is relatively shorter as compared to the mammals. Pheasants belong to the group of wild birds which are seasonal breeders. Their population is large and can be breed easily. Therefore it is believed that pheasants will be the best experimental animals for study of endangered birds. This study was conducted to develop techniques for the restoration of endangered birds using spermatogonial stem cells by interspecies germline chimeras between pheasant (Phasianus colchicus) and chicken (Gallus gallus). In the current study emphasis has been given on the establishment of spermatogonial stem cell line as an animal model for research. Isolation of spermatogonial stem cells was performed from the surgically removed testis from pheasant. Growth conditions for pheasant spermatogonial stem cells by co-culturing pheasant STO basal cells and somatic cells using spermatogonial stem cells of chickens were established. In this study, subculturing was performed for the establishment of cell line. Colony forming cells divided and proliferated stably to the cell lines in the positive direction. Further, no expression of Oct4, Nanog, Thy1, SSEA-1 and SSEA-4 was observed as of specific expression markers in pheasant spermatogonial stem cells, but GFRa1 expressed significantly. GFRa1 is known to promote proliferation factors of spermatogonial stem cells. Testis of the recipient were made infertile and 4-16 weeks old chickens were injected busulfan (heated at 41 ℃) at 2 weeks intervals. Infertility efficiency of chickens after sexual maturation was measured by generating and establishing most idealized mechanism for infertile chickens. An infertility was induced in 40 % young chickens of 4 or 6 weeks age. Significantly, more than 70 % of sterilizing percentage except only among 8 and 10 weeks of age has been observed (P ＜ 0.05). It has been observed that if we use 8 weeks old recipient chickens, we can get good results of cell injection using pheasants. Similarily, sex cells recovery percentage from the chickens was measured at the end of experiment and 5 % sex cells were recovered after 8 weeks. When pheasant cells are seated correctly, we can generate highly efficient chimeras. 92.87 % of cells using the c-kit, cultured cells for the efficient mass culture of spermatogonial stem cells. The results of culture capability were significantly different as compared to non-isolated cells and demonstrated the potential of c-kit which marker which can be used as a separation marker of spermatogonial stem cells in pheasants. Finally, Generation of chimeras has been tried through the transplantation of pheasant spermatogonial stem cells into recipient embryos. Even though embryo survival incidence was low, but initial survival rate was enough. To measure the percentage of donor sex cell moved to gonad after microinjection, staining of sex cells of pheasant with PKH-26 was performed and 30 % donor cells in the gonad of recipient chicken were observed. The distribution of stem cells in the transplanted sex cells were confirmed by FACs analysis. The c-kit/CD117 positive cells were analyzed at a rate of about 9.48 %, and it has been engrafted stably in the gonad of the recipient. These results suggest that induction of infertility and growth of the transplanted cells are developed when technologies of proliferation using spermatogonial stem cell line of pheasants or endangered birds are adopted. It is possible to develop production technologies of efficient interspecies germline chimeras in avians and also, it could be used to restore the endangered birds. Therefore, from the current study it is concluded that avian spermatogonial stem cells are highly useful for the conservation of endangered birds and the production of germline chimeras. It is believed that further research is needed for the production of efficient interspecies germline chimeras and if it has stable supplies and systems, we can try to apply for restoring the endangered birds.