생물고분자 생산 초산균과 에탄올 효모의 혼합배양

Abstract

산패 포도주에 형성된 피막(pellicle)로부터 초산발효 세균을 순수 분리하여, 발효음료의 생산이나 식용, 의료용, 화장품용 또는 생분해성 플라스틱 합성용 생물고분자(biolpolymer)의 생산에 활용하고자 하였다. 분리주 NOK21은 그람음성의 호기성 간균이며, capric acid를 탄소원으로 이용할 수 있었다. 16S-rRNA 유전자의 일부 염기서열 1,380bp를 분석하여 NCBI의 GenBank data와 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1,380bp에 상당하는 염기서열 중에 99.7% 이상 일치하는 균주 대부분이 Gluconacetobacter hansenii이었다. G. hansenii는 에탄올을 산화시켜 초산을 생산하고, 섬유질성 고분자막을 만드는 것으로 보고되어 있다. NOK21이 생산하는 두터운 불용성 피막의 구성 성분을 solid 13C-NMR spectroscopy로 구성 탄소원자의 종류를 분석하였다. NOK21의 고분자를 분석한 결과, 포도당의 β-1.4 결합으로 이루어진 순수한 celluose가 아니고, 우론산(uronic acid, RCOOH), 에스테르(ester, RCOOR) 또는 아미드(amide, RCONH-) 그리고 아세틸기(acetyl group, CH3COO-)에 해당하는 탄소 원자들을 함유하고 있다. 따라서 NOK21의 고분자는 순수한 cellulose 형태가 아니고, 아세틸화된 고유의 다당류로 추정되며, 히아루론산(hyaluronic acid, hyaluronan)일 가능성도 있다. 에탄올 농도가 NOK21의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 배지 중의 에탄올 농도를 0에서 8%까지 달리하여 배양기간에 따른 초산과 생물고분자 농도의 변화를 측정하였다. 생육속도는 에탄올 농도 3% 수준에서 최고였고, 산을 생성하고 피막 생물고분자를 만들었다. 생물고분자의 농도는 에탄올 농도 3%에서 최대 농도 5.2 g/ℓ를 나타내었다. 한편 에탄올 농도 5%에서 배양 15일 만에 3.97% 상당하는 최고의 산도를 보였다. 그러나 에탄올 농도 6% 이상에서는 초산균의 생육이 관찰되지 않았다. 포도당을 2~20%함유한 배지에서 초산균과 에탄올 발효 효모 S. cerevisiae를 혼합 배양하였을 때, 포도당 농도가 비교적 낮은 2%와 5%일 때에는, 에탄올이 먼저 생기고 나서 산과 생물고분자가 생산되었다. 이로부터 효모가 포도당을 에탄올로 발효시키고, 이어서 세균 NOK21이 에탄올을 초산으로 산화시키고, biopolymer를 합성했음을 알 수 있었다. 포도당 농도 10% 이상에서는 효모가 자라면서 에탄올이 왕성하게 만들어졌으나, 초산세균 NOK21의 생육은 저해되어 초산과 피막 생물고분자는 생성되지 않았다. 그러나 효모의 농도는 배지 중 포도당 농도의 변화에도 불구하고 1.0×107 cells/㎖ 수준에서 비교적 일정하게 유지되었다. 또한 포도당의 농도가 높을수록 에탄올의 농도도 높은 경향을 보였다. 본 연구에서 포도주로부터 분리된 NOK21은 G. hansenii와 유사한 초산발효 세균이며, 에탄올 발효효모와 공생하면서 포도당을 기질로 이용하여 초산과 산성의 biopolymer를 합성함을 보여주었다. 이러한 연구 결과는 Kombucha와 같은 발효 음료의 생산과 히아루론산과 같은 생물고분자의 대량생산에 유용할 것이다.

From the pellicle membrane of rancid wine, an acetic acid bacterium NOK21, which was intended to be used as an inoculum for fermented sour drinks or a producer of biopolymer applicable to diet food, pharmaceuticals, cosmetics or bioplastic industries, was isolated and purified. The isolated bacterium was Gram-negative, aerobic, and rod-shaped bacterium, which could assimilate capric acid as a carbon source. The partial 1,380bp nucleotide sequences of its 16S-rRNA gene were determined and compared with those of some known bacterium through blast search of GenBank data in NCBI, USA. The bacteria showing greater than 99.7% homology mostly belonged to Gluconacetobacter hansenii species. The G. hansenii has been well-known as an acetic acid bacteria producing cellulose polymer. The thick insoluble membrane formed by the NOK21 was subjected to solid 13C-NMR spectroscopy to analyze the types of its constituting carbon atoms. The 13C-NMR spectrum of the water-insoluble polymer suggested that the biopolymer was not pure cellulose. It was estimated to be a new acetylated biopolymer such as hyaluronic acid(hyaluronan) containing carboxyl, amide(or ester) and acetyl groups. The changes in culture acidity and biopolymer concentration during cultivations were measured to investigate the effects of ethanol concentrations from 0 to 8% on NOK21 bacterial growth. The growth rate showed the greater in the medium containing 3% ethanol where the bacteria produced both acid and insoluble biopolymer. The biopolymer concentration reached the maximum 5.2g/ℓ in 3% ethanol-containing medium whereas the highest acidity 3.97% was observed in the 5% ethanol-containing medium. No bacterial growth was observed in the medium containing greater than 6% ethanol. When the bacteria NOK21 and yeast Saccharomyces cerevisiae were co-cultivated simultaneously in the medium containing glucose 2~20%, both acid and biopolymer were produced only in the media containing relatively low glucose concentration at 2% and 5%. In addition, ethanol was produced prior to the acid and biopolymer production, which suggested that the yeast converted glucose to ethanol first, and the bacteria oxidized ethanol into acetic acid and synthesized biopolymer. Although the yeast made ethanol to a great degree at glucose concentration higher than 10%, no production of either acid or biopolymer was observed probably due to the inhibition of NOK21 bacterial growth. Meanwhile, the yeast cell concentration was maintained at quite constant level at 1.0×107 cells/㎖ throughout all the media containing glucose 2~20%. The greater glucose concentration in the culture medium showed a tendency of higher ethanol production. This research demonstrated that the isolate NOK21 belonged to acetic acid bacterial group like G. hansenii and synthesized organic acid and new acidic biopolymer like hyaluronan during co-cultivation with ethanol-fermenting yeast S. cerevisiae. These results will be useful for the mass production of such fermented health drinks as Kombucha and hydrogel-like biopolymer.