Improving ginsenoside content in Korean wild ginseng (Panax ginseng Meyer) through different biotechnological approaches

Abstract

인삼은 동양사람들에게 널리 이용되어온 가장 오래 된 약초 중의 하나이고, 이 인삼의 주요 성분인 진세노사이드는 30여종이 알려져 있다. 감마선(γ-ray)이 산삼 부정근의 성장 및 진세노사이드 함량에 미치는 영향을 평가하기 위해, 산삼 뿌리 유래의 부정근에 25, 50, 75, 100, 125Gy의 감마선을 조사하여 돌연변이를 유도하였다. 감마선(60Co) 조사는 제주대학교 원자력과학기술연구소에서 수행하였다. 감마선을 조사한 부정근은 30일간 플라스크 배양한 후, 형성된secondary root의 수를 조사하여 선발하였다. 감마선을 조사하지 않은 야생형과 선발된 변이 부정근의 진세노사이드 (Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rc, Rb2와 Rd) 함량은 HPLC와 PDA검출기를 이용하여 측정하였으며, Digoxin을 internal standard로 사용하였다. 그 결과, 50Gy 이상의 방사선을 조사한 처리구에서는 secondary root의 수가 야생형에 비해 적었고, 50Gy 이하의 방사선을 조사한 처리구에서 야생형보다 secondary root의 수가 많은 변이 부정근을 선발할 수 있었다. 따라서 진세노사이드의 생산성을 높이기 위한 방사선량으로는50Gy 이하가 적합함을 알 수 있었다. Secondary root의 수가 야생형보다 많은 5개의 계통을 선발한 후, 한달 간 플라스크에 배양하여 건조중량을 측정한 결과, 야생형은 0.31g이었고, 선발한 1, 3, 9, 13 및 14 번 계통들은 각각 0.46g, 0.45g, 0.29g, 0.34g, 0.48g 이었다. 생장율은 야생형이 4.42 였으며, 선발한 계통들인1, 3, 9, 13, 14번은 각각 6.57, 6.48, 4.10, 4.90, 6.90 이었다. 선발한 1, 3, 14번 계통들의 생장율은 야생형에 비해 각각 49%, 47%, 57% 증가하였다. 총 진세노사이드 함량은 1번 계통에서 가장 크게 증가하였고, 1번 계통의 총 진세노사이드 (Rg1, Re, Rf, Rh1, Rb1, Rc, Rb2, Rd) 함량은 야생형과 비교하여 약 1.6배 증가하였다. 또한, 이 계통의 진세노사이드 중 Rg1, Re, Rh1과 Rb2의 함량은 야생형에 비해 2-3배 증가하였음을 알 수 있었다. 3번 계통의 진세노사이드 Re, Rh1, Rb2, Rc 와 Rd 함량은 야생형에 비해 1.6-2.3배 증가하였으며, 9번 계통에서는 진세노사이드 Rg1, Re 와 Rh1 함량이 야생형에 비해 1.7-2배 증가하였다. 4번 계통의 진세노사이드 함량은 야생형과 비슷하였고, 13번 계통의 진세노사이드 함량은 야생형에 비해 감소하였음을 알 수 있었다. 이들 결과로부터, 선발한 변이 계통들 중 1번 계통이 가장 높은 진세노사이드 함량을 가지고 있음을 알 수 있었다. 본 연구결과 우리는 biomass 생산성과 진세노사이드 함량이 크게 증가된 돌연변이 세포주를 선발할 수 있었으며, 감마선 조사는 2차 대사산물 특히 진세노사이드의 생산량 증대에 있어 강력하고 유용한 수단임을 확인할 수 있었다. 이 결과는 감마선 조사가 진세노사이드 합성에 필요한 효소의 활성 등에 영향을 미쳤음을 시사한다. 인삼은 성장이 느리고 긴 생산주기 (4-6년)를 가지고 있는 다년생 식물이며, 종자를 생산하기까지 3년이상의 유년기가 필요하다. 이러한 특성 때문에 전통육종에 의한 우수 유전자형의 창출은 매우 어려운 실정이다. 또한, 지금까지 산삼의 부정근에 방사선을 조사한 후 그 돌연변이 부정근을 재분화한 보고는 없다. 따라서, 본 연구에서는 인삼의 신품종 육성을 위해 진세노사이드 함량이 증가된 변이 세포주를 이용한 식물 재분화계를 확립하였다. 여기서 확립된 재분화 시스템은 인삼식물의 형질전환에도 활용될 수 있을 것이다. 한국 산삼의 체세포배발생과 식물체 재분화를 위하여 부정근 유래의 캘러스로부터 체세포배를 유도한 결과, 0.5 mg/L 2,4-D가 포함된 배지에서 가장 높은 빈도로 유도되었고, 야생형과 돌연변이 부정근의 체세포배 형성 빈도는 각각 15.3% 와 14.7% 였다. 야생형과 돌연변이 부정근의 체세포배 형성수는 각 캘러스 당 각각 25.6개와 23.7개였으며, 야생형과 돌연변이 부정근의 체세포배 형성 빈도에는 유의 차가 없었다. Globular형태의 체세포배는 배발생 캘러스의 표면에 형성되었다. 체세포배발생으로부터 식물체 재분화에 미치는 GA3의 영향을 평가한 결과, GA3 무처리구에서는 36%의 재분화효율을 보였으나, 5 mg/L의 GA3처리구에서는 85% 로 가장 높은 재분화효율을 보였다. 배의 성숙과 재분화는 GA3 의 농도에 크게 영향을 받았으며, 발아한 배는 5 mg/L GA3가 포함된 MS배지에서 식물체로 발달하여 성장하였다. 뿌리가 형성되지 않은 식물체는 MS 또는 SH 기본 배지에 0.25 mg/L NAA 혹은 0.5% 활성탄이 포함된 배지에 옮겨 약 1달후 뿌리유도 효율을 평가하였다. 그 결과, 유도된 뿌리의 질은, 0.25 mg/L NAA 와 1%의 sucurose가 첨가된 1/3 SH 배지에서 빠르고 두껍게 성장하여 가장 좋은 결과를 보였다. 0.5%의 활성탄과 2% sucrose가 첨가된 1/3 SH 배지에서 뿌리 유도 효율이 가장 높았으나, 이 배지에서 유도된 뿌리는 잘 자라는 반면 약한 단점이 있었다. 따라서 뿌리유도를 위한 최적 배지는 0.25 mg/L NAA 와 1%의 설탕을 첨가한 1/3 SH배지였다. 뿌리가 잘 발달한 산삼 재분화 식물체는 인공 혼합토 [peatmoss:vermiculite: perlite=2:3:1(v/v)]를 넣은 플라스틱 화분 (10x18cm)에 이식하여 생장실에서 순화하였다. 순화 3개월 후 신초가 형성되어 성장하기 시작하였으며 생존율은 약 30% 였다. 본 연구에서는 중요한 약용식물인 산삼의 효율적인 재분화계를 확립하였고, 이 프로토콜은 한국 산삼의 빠른 대량 생산을 가능하게 해줄 것으로 기대된다. 산삼 부정근으로부터 캘러스를 유도하여 재분화 식물을 얻기까지는 약 6-8개월이 소요되었다. 본 연구에서는 방사선조사를 통해 얻은 돌연변이 부정근으로부터 식물체를 재분화하였고, 감마선을 이용한 돌연변이 기술과 조직배양에 의한 식물재분화 기술의 융합은 인삼 품종개량에 있어서 효과적인 방법의 하나가 될 수 있을 것으로 생각된다. 산삼 돌연변이 부정근의 진세노사이드 생산성을 개량하기 위하여 합성 스쿠알렌 신타아제(PgSS2) 유전자를 35S 프로모터하에 도입한 후 산삼의 돌연변이 부정근에 형질전환을 수행하였다. 형질전환은 돌연변이 산삼 부정근 계통에서 선발한 배발생캘러스를 PgSS2 유전자와 bar 유전자를 포함하는 아그로박테리움 EHA105에 감염하여 수행하였다. 형질전환체는 phosphinothricin (PPT) 3mg/L를 첨가한 MS배지에서 선발하였다. 그 결과, 10개체의 PPT-저항성 식물을 선발하였고, 이 식물체들의 유전자 도입은 PAT strip test와 Southern blot분석을 통하여 확인하였다. 유전자의 도입이 확인된 산삼 형질전환 식물을 이용하여 스쿠알렌 신타아제(PgSS2) 유전자가 진세노사이드의 생합성에서 어떤 역할을 하는지를 조사하였다. 형질전환 산삼 식물 계통들에서 재분화시킨 부정근을 한달 간 배양한 후 총 진세노사이드 함량을 분석한 결과, 형질전환 계통 1, 2, 5, 7, 8번은 비형질전환 돌연변이 부정근보다 진세노사이드 함량이 약 1.3-1.6배 증가하였음을 확인하였다. 또한, 이들 형질전환 계통들 중 1번과 8번의 진세노사이드 함량이 야생형 및 공벡터가 도입된 계통들보다 약 1.6배로 가장 높게 나타났다. 이들 결과로부터 형질전환 기술은 진세노사이드 축적이라는 관점에서 인삼의 개량을 용이하게 해 줄 것으로 생각된다. 감마선을 이용한 돌연변이 기술, 식물재분화 및 형질전환 기술의 융합은 새로운 인삼 품종의 개발에 매우 효과적인 방법의 하나가 될 것이다.