Molecular cloning and Characterization of flavonoid 7-O-glycosyltransferase(bGT3292) from Citrus platymamma hort. Ex Tanaka

Abstract

병귤은 국내에서 재배되고 있는 재래귤이지만 대중에게는 생소한 품종으로서 연구 및 개발이 잘 되지 않았다. 이러한 병귤을 연구개발하는 방향으로 병귤의 genome으로부터 기능성 유전자를 발굴하게 되었다. 귤에는 플라보노이드 성분이 다량으로 포함되어 있고, Flavonoid는 항균, 항암, 항바이러스 등 많은 생리활성을 갖는다고 알려져 있다. 이번 실험에서는 귤에 많이 들어있는 플라보노이드 중 6가지인 apigenin, eriodictyol, kaempfeol, luteolin, naringenin, quercetin을 기질로서 사용하였다. 당전이효소(glucosyltransferase, GT)는 Flavonoid와 같은 이차대사산물에 당을 전달하는 기능을 한다. Flavonoid에 당이 붙어있지 않은 상태를 아글리콘(aglycone)이라고 하는데 당전이효소에 의해서 당이 붙은 배당체(glycoside)로 전환한다. 당전이효소는 여러 가지 종류가 존재하는데 이러한 효소들은 각기 다른 활성을 나타낸다. 당전이효소는 위치특이성(regio-specificity)과 기질 공여체 특이성(substrate donor specificity)를 갖는다. Flavonoid 의 한 종류인 quercetin은 다섯 곳에 -OH 잔기를 갖는다. 각 각의-OH 잔기마다 활성을 나타낼 수 있는 당전이 효소가 다르다. 그리고 활성을 나타낸 위치에 따라서 그 flavonoid -glucoside 의 생리활성이 다르게 나타난다. 기질 공여체 특이성은 당전이효소의 종류에 따라서 Flavonoid에 결합시키는 당의 종류가 다르다는 것을 나타낸다. Glucosylation이 일어날 때 Glucose가 어떤 위치에 일어나는가에 따라서 항산화효과가 증가되거나 감소가 될 수 있다는 보고가 있다. Glucosylation으로 인해 -OH 그룹이 보호됨으로써 Auto-oxidation이 일어나지 않게 되어서 Flavonoid가 갖고 있는 항산화효과가 필요하지 않는 곳에서 일어나는 것을 방지하게 된다. 기질특이성을 검정하기 위해 HPLC와 LC-MS를 진행하였다. Standard, product, MS data와 spectrum결과를 비교하여서 기질특이성 검정을 수행하였다. 활성테스트에 사용된 Aglycone의 피크가 줄어들고 product peak가 생성되는 것을 볼 수 있었다. Major peak로서 생성되는 생성물이 flavonoid7-glucoside 가 맞으나 minor peak로 나타나는 생성물로서 flavonoid 4`-glucoside라는 것을 확인하였다. 기존에 UGT73C5 와 UGT74F1는 Quercetin에 대해서 7 –OH와 4`-OH에 활성이 있다는 보고가 있다. 하지만 UGT73C5는 bGT3292와는 다르게 4`-OH에 활성이 더 높은 것으로 보고되었다. UGT74F1(Group L)의 경우 bGT3292(Group D)와 amino acid sequence가 다른데도 불구하고 비슷한 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 서열상으로 similarity가 다르더라도 비슷한 활성을 나타낼 수 있기 때문에 직접 activity test를 해봐야 한다는 것을 의미한다. 다양한 Glucosyltransferase의 활성에 대한 연구는 glucosyltrasferase의 활성에 대한 기작을 분석하고 연구하는데 도움이 될 것이라 생각된다.

An UDP-glucosyltransferase (bGT3292) was isolated from the leaf of Citrus platymamma hort. ex Tanaka (Rutaceae family) and was expressed in Escherichia coli. The expressed protein was investigated for its specific activity, using various substrates such as apigenin, eriodictyol, kaempferol, luteolin, naringenin, quercetin. bGT3292 was found to be a flavonoid-7-o-glucosyltrtansferase and was classified into group D that has a glucosyl transferase activity on flavonol. However, different from other flavonoid-7-o- glucosyltrtansferases, bGT3292 also can produce luteolin-4'-o-glucoside and quercetin -4'-o-luteolin. 7-OH of naringenin was best modification site among substrates used. In citrus plant, bGT3292 was higher expressed in Flower than in fruit, leaf, and stem.