Niemann-Pick type C1 like 1의 N-terminal domain과 結合하는 cholesterol과 그 誘導體들의 結合構造 硏究

Abstract

본 연구에서는 체내의 콜레스테롤 항상성 유지에 중요한 역할을 하는 군단백 질인 NPC1L1의 NTD와 NPC1 NTD의 결합구조를 비교함으로써 아직 실험적으 로 보고되지 않은 NPC1L1 NTD과 콜레스테롤 결합구조를 모델링하고, 콜레스테 롤 유통에 중요한 역할을 하는 이들의 결합구조를 NPC1 NTD와의 비교분석을 통해 유추하고자 한다. AutoDock 4.2 프로그램을 사용하여 두 가지 단백질 즉, NPC1L1 NTD(PDB ID: 3QNT)와 NPC1 NTD(PDB ID: 3GKH)에 각각 다른 특 성을 가지고 결합한다고 알려진 3 가지 리간드(콜레스테롤, 25-HC, β-SITO)에 대해 모델링을 통한 도킹을 시도하여 열역학적으로 가장 안정한 결합구조를 예 측하였다. 결합구조가 알려진 3GKI와 3GKJ에서 각각의 리간드를 분리하여 콜레 스테롤과 25-HC의 초기 리간드로 사용했고, β-SITO는 Spartan'10 프로그램으로 만들어 사용하였다. 모델링은 비극성원자까지 포함한 전원자수준(all-atom level) 으로 진행하였고 이면각회전이 가능한 비틀림 부위가 콜레스테롤에 6개, 25-HC 와 β-SITO에는 각각 7개로, 최대한 많은 결합이 회전할 수 있도록 모두 Active torsion으로 지정하였다. 그리드 상자의 크기는 NPC1 및 NPC1L1의 NTD에 있 는 소수성 결합부위를 충분히 둘러쌀 수 있도록 60×60×60으로, 그리드 상자의 중심좌표는 x = -17.0, y = -29.0, z = -18.0으로 지정하고 도킹 결과가 일관성 있게 도출되도록 도킹시도 횟수는 500회로 변경하였으나 나머지는 도킹 프로그 램의 기본 값을 그대로 사용했다. 모든 도킹은 Rigid receptor 도킹과 Flexible receptor 도킹의 두 가지 조건에서 수행되었고 Flexible receptor 조건에서는 최 대 9개의 잔기들에 유연성이 부여되었다. 도킹 결과, 3 가지 리간드 모두 NPC1 NTD나 NPC1L1 NTD와 소수성 결합부위 내에서 결합했으며 실험적으로 보고되 었던 NPC1 NTD 결합구조(PDB ID: 3GKI, 3GKJ)와 동일한 방향(RB 방향)으로 결합했을 때, 결합에너지(△G)와 K_(i)가 가장 낮게 나타났다. 한편, 리간드 종류에 따른 도킹 퍼센트는 콜레스테롤, 25-HC, β-SITO 순으로 낮았으며, 최적결합구 조의 결합에너지(△G)는 β-SITO, 25-HC, 콜레스테롤, 또는 25-HC, 콜레스테롤, β-SITO 순으로 낮았다. 즉, 리간드 종류에 따른 결합구조의 특성이 두 단백질에 서 다르게 나타났고, 전반적으로 NPC1 NTD에 비해 NPC1L1 NTD와 리간드 결 합의 안정성이 떨어지는 경향을 보여 두 단백질이 서로 다른 결합구조를 가질 여지가 있는 것으로 추정되었다. 다음으로 분자도킹실험에서 얻은 결합구조 중에서 가장 결합에너지가 낮았던 최적결합구조를 가지고 주기적 경계조건 하에서 GROMACS 4.6.5를 이용한 분자 동력학 모의실험을 실시하였다. 각 단백질은 수소원자를 첨가한 후 Amber03 Force field를 사용하여 topology를 생성하였고 리간드의 topology는 Antechamber를 사용하여 생성하였다. 또한, 모의실험 상자는 12면체를 사용하였 으며, 그 안에서 단백질과 리간드를 결합시키고 수용액을 추가하여 TIP3P 물분 자 모의실험 상자를 형성하였다. 시스템은 NVT 앙상블에서 0.0 K에서 300.0 K 가 될 때까지 200 ps 동안 1 bar 하에서 가열되었고 MD simulation은 2 fs의 간 격으로 50 ns 동안 수행되었으며, 궤적은 2 ps마다, 에너지의 좌표들은 매 0.4 ps 마다 저장되었다. 0에서 50 ns사이에 생성된 결합구조들이 시간의 흐름에 따라 분포가 안정해졌는지 확인하기 위해 실험적으로 보고된 비결합 구조(NPC1 NTD, 3GKI; NPC1L1 NTD, 3QNT)에 대한 원자간 거리의 RMSD로 그래프를 그려 확인하였다. MD simulation에서 일정한 구조분포를 이룬 상태에서 비결합 와 결합구조 각각 100개씩을 선발하여 동일한 위치의 고리들 간의 거리를 RMSD의 평균값으로 나타내었으며, 초기의 위치에 대하여 시간에 따라 변화된 각 잔기들의 거리를 RMSF로 계산하여 그래프로 나타내어 비교하였다. 또한 40 부터 50 ns 사이에 구조 5개씩을 선발하여 총 8군데 고리들에서 리간드 결합 전 후의 위치변화를 비교했다. 여기서도 도킹 결과에서 나타난 두 단백질의 결합구 조 차이가 동일하게 관찰되었는데, NPC1 NTD는 콜레스테롤과 결합할 때 L5(1.1 Å)와 L6(1.2 Å)에서만 위치변화가 있었으나, NPC1L1 NTD는 콜레스테롤 과 결합할 때 L1(1.1 Å)과 L2(2.6 Å), L5(1.3 Å), L6(1.2 Å), L8(1.5 Å)에서 위치 변화가 있어 NPC1 NTD와 NPC1L1 NTD의 결합구조가 서로 다름을 시사했다. NPC1 NTD의 결합구조에서는 리간드 결합부위와 먼 L5, L6에서 리간드별로 큰 위치변화가 관찰되었고 반면, NPC1L1 NTD는 결합부위 입구의 L1과 L2가 크게 움직여 리간드 결합전후의 구조변화에 크게 기여했고, 다른 고리들의 위치변화도 컸다. 본 연구 결과, NPC1L1 NTD의 L1과 L2는 콜레스테롤 등 리간드의 결합과 관 련이 있을 것으로 예상되었고 NPC1L1 NTD는 NPC2와의 상호작용과 같은 결합 기전에서 NPC1 NTD와는 차이가 있어 이러한 차이가 L1과 L2에서의 뚜렷한 위 치변화와 연관될 가능성이 있다. NPC1L1 NTD는 리간드 종류에 따라 L2와 L6 의 위치가 달랐으며, 콜레스테롤 결합구조에서 보인 L2와 L6의 위치변화가 다량 의 콜레스테롤을 수송하는 내재화를 개시하는 NPC1L1 NTD의 구조적인 변화로 추정되었다. 결합된 리간드 종류에 따라 독특한 위치변화를 나타내었던 NPC1의 L5와 L6은 다른 내강 도메인들(C와 I)과 인접해있어 이들의 위치변화를 통해 NTD의 리간드 결합이 다른 내강 도메인에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 제시 되었다. 즉, NPC1 NTD과 NPC1L1 NTD는 결합구조가 다르며, 리간드별 독특한 위치변화를 나타낸 고리도 달라 두 단백질은 결합구조 뿐 아니라 결합기전이나 결합 후의 작용에도 차이가 있을 가능성이 있어보였다. NPC1L1도 NPC1처럼 도 메인 C와 I, NTD가 비교적 근거리에 위치하여 내강 도메인들 간의 상호작용이 NPC1L1의 기능에 반영될 여지가 있을 것으로 예상된다. 콜레스테롤의 내재화 경로에 대한 NPC1L1 NTD의 구조변화가 NPC1 NTD와는 다른 방식으로 다른 도메인들 또는 전체 단백질 구조에 영향을 미칠 것이므로 본 연구에서 위치변화 가 관찰된 주요 고리들에 대한 돌연변이 생성실험으로 내강 도메인들 간의 상호 작용에 미치는 영향이 확인된다면 NPC1L1에 의한 콜레스테롤 수송에 대한 이해 를 증진시킬 수 있으리라 기대한다.

Niemann-Pick type C1 like 1(NPC1L1) is a membrane protein that is expressed in brush border membrane of small intestine and canalicular membrane of liver. It mediates dietary cholesterol absorption and biliary cholesterol re-absorption. As a Niemann-Pick type C(NPC) family protein, it has sequence homology and conformational similarity with Niemann-Pick type C1(NPC1). Like NPC1, NPC1L1 has N-terminal domain(NTD) including hydrophobic binding pocket which directly binds with cholesterol. Due to their conformational similarities in NTD hydrophobic pockets, it is believed that both NPC1L1 NTD and NPC1 NTD have similar binding mode with cholesterol. Unlike NPC1 NTD the experimental structure of NPC1L1 NTD in complex with cholesterol is not available. In this study, the structure of NPC1 NTD and NPC1L1 NTD in complex with cholesterol and its derivatives are compared using computational modeling, i.e, molecular docking and molecular dynamics(MD) simulation. We have employed AutoDock ver. 4.2 to obtain the binding structures. For cholesterol, 25-HC, and β-SITO, the resulting complex structures show stable binding modes in the hydrophobic pocket of both NPC1 NTD and NPC1L1 NTD. And all ligands have the same orientation as observed in crystal structure of NPC1 NTD cholesterol complex. However, there are subtle differences in binding modes between these complexes, especially between NPC1 NTD complexes and NPC1L1 NTD complexes due to the difference in detailed sequence and ligand structure. It is also observed that the binding free energy with NPC1 NTD is more stable than that of NPC1L1 NTD for all three ligands. To further understand their structural differences as a collection of dynamical ensemble structures rather than static structure, we have performed the molecular dynamics (MD) simulations with GROMACS ver. 4.6.5. The MD simulations are started from both bound and unbound structures for each of NPC1 NTD and NPC1L1 NTD with three ligands, resulting in six independent MD simulations. Analysis of the 50 ns MD trajectories indicates there is difference in loop region L6 after binding with li gand for NPC1 NTD. Meanwhile for NPC1L1 NTD, loop L1, L2, L5, and L8, especially L1 and L2, show structural change after ligand binding. And L2 and L6 shows noticeable structural change after only cholesterol binding for NPC1L1 NTD. The current study indicates that for cholesterol between NPC1 NTD and NPC1L1 NTD, there is difference not only in detailed binding modes but also the loop structure after binding. The structural change after binding with ligand could play as a signal for a series of subsequent events. Very recently, the whole structure of NPC1 is reported and its luminal domains are in close contact. Therefore, this modeling study suggest that there could be difference in cholesterol internalization pathway between NPC1 and NPC1L1, especially the initiation step right after cholesterol binding to NTD. We believe the current study can improve our understanding of cholesterol transportation in NPC1L1 and NPC1 from structural perspective. For example, the loop region L2 and L6 we have identified here for NPC1L1 NTD could serve as a target sequences for further mutagenesis study in internalization of cholesterol and its derivatives.