콤부차 대표 균주 3종을 이용한 감귤 발효액의 기능성 연구

Abstract

콤부차는 약간 달고, 신맛이 나는 발효 음료로 높은 항산화 능력, 산화적 스트 레스에 대한 간 보호 효과, 항 당뇨 및 항암효과가 있는 것으로 밝혀져 있다. 본 연구에서는 콤부차 유래 3가지 균주를 이용하여 발효시킨 감귤 발효액 (CK-MOX)의 항산화 능력 평가, 방광암 세포주에 대한 항암성 확인 및 LPS를 처리한 RAW264.7대식세포에 대한 항염성 효과를 알아보고자 하였다. 전통적인 방법으로 배양 된 콤부차에서 분리한 3가지 균주를 감귤 농축액과 녹 차추출물 혼합액에 접종하여 15일간 발효하며, 매 3일마다 샘플링을 실시하였다. 발효 기간에 따른 이화학적 특성 변화를 살펴보기 위하여 pH, 산도, 총 당 및 환 원당을 측정하였으며, 발효 기간이 지남에 따라 pH와 총 당의 함량은 발효 전 (Day 0)과 비교하여 발효 후(Day15) 유의적으로 감소하였고, 산도는 유의적으로 증가하였다. 항산화 능력 평가를 위해 DPPH, ABTS radical scavenging assay, Folin-Denis assay 및 ORAC assay를 실시하였다. 그 결과 발효 기간이 지남에 따라 DPPH, ABTS 라디칼 소거능 및 ORAC 측정 결과는 발효 전과 비교하여 유의적으로 증 가하였으며, 총 폴리페놀 함량은 미량 감소하였다. LPS로 유도한 RAW264.7 대식세포의 염증반응에 미치는 영향을 알아보기 위하 여 Nitric oxide (NO) 생성량을 측정한 결과 CK-MOX의 처리는 NO 형성을 약 50% 억제하는 것으로 나타났으며, LPS 단독 처리 군과 비교하여 15일간 발효 한 시료(Day15) 처리 군에서 염증관여 인자로 알려진 TNF-α, IL-1β의 mRNA 생성량이 감소하는 것으로 나타났다. 세 개의 방광암 세포주(EJ, T24, 5637 cells)에 대한 세포 성장 억제능력은 MTT, Annexin V assay, 이동성 변화, western immunoblot으로 측정하였다. 방 광암 세포주의 생존율은 CK-MOX 처리에 농도 의존적으로 낮아졌으며, 발효 전(Day0)과 비교하여 발효 후(Day15) 시료는 EJ와 5637 세포의 이동성을 각각 69, 49% 억제하는 것으로 나타났다. Apoptosis 유래 Annexin V 실험결과 발효 후 (Day15)시료처리 군은 발효 전(Day0) 시료 처리 군과 비교하여 apoptosis로 인 한 세포의 사멸률이 더 높게 나타났으며, 15일간 발효 한 시료의 처리는 방광암 세포주(EJ, T24, 5637 세포)의 p-ERK level을 증가시키는 것으로 나타났다. p-ERK에 의한 세포 사멸은 MEK1/2 inhibitor인 U0126를 처리 했을 때 감소하 는 것으로 보아 콤부차 대표 균주 3종을 이용한 감귤 발효액(CK-MOX)의 방광암 세포 사멸에 p-ERK가 깊이 관여함을 알 수 있다. 본 연구 결과 콤부차 대표 균주 3종을 이용한 감귤 발효액(CK-MOX)은 높은 항산화능력과 항염증 효과 및 EJ, T24, 5637 방광암 세포의 p-ERK 수준을 상향조절 함으로서 성장 억제력을 갖는 것으로 나타나 콤부차 유래 3종 균주를 이용한 감귤 발효액의 기능성 음료로서의 개발 가능성을 확인 하였다.

Dysregulation of the body`s antioxidant defense system causes oxidative stress, chronic inflammation, and various diseases such as diabetes and cancer. Kombucha is slightly sweet and sour beverage that has strong antioxidant capacity. It has been shown that Kombucha protects the liver against oxidative stress and possesses anti-diabetic and anti-cancer effects. Despite its benefits to public health, commercialization of kombucha has been limited mainly due to non-defined nature of microbes used for fermentation. In this study, we investigated Citrus Kombucha (CK) produced by innoculating three different bacteria strains (Gluconoacetobacter xylinus, Gluconoacetobacter medellinensis, Gluconobacter oxydans; named as CK-MOX) isolated from traditional Kombucha. Fermentation was performed for 15 days with monitoring changes of physicochemical properties including pH, acidity, and total and reducing sugar contents. During fermentation, pH and total sugar content were gradually decreased while acidity was slightly increased. Antioxidant capacity, measured by DPPH, ABTS, Folin-Denis, and ORAC assays, markedly increased in post-fermented CK-MOX (Day 15) compared to the pre-fermented CK-MOX (Day 0). However, the total polyphenol content was slightly decreased after fermentation. Biological properties including antioxidant and anti-cancer activities of CK-MOX were also investigated for three different bladder cancer cell lines (EJ, T24, and 5637 cells). To investigate the anti-inflammatory effect of CK-MOX on LPS-induced inflammatory RAW264.7 cells, nitric oxide (NO) production and inflammatory cytokine (TNF-α and 1l-1β) levels were measured. Treatment of post-fermented CK-MOX (Day15) inhibited NO production and reduced TNF-α and IL-1β mRNA expresstion in LPS-induced RAW264.7 cells as compared with pre-fermented CK-MOX (Day 0). In addition, post-fermented CK-MOX (Day 15) markedly inhibited proliferation and migration of EJ, T24, and 5637 cells (human bladder carcinoma). Interestingly, treatment of post-fermented CK-MOX (Day 15) resulted in up-regulation of ERK. To distinguish whether up-regulation of ERK is the cause or the effect, we investigated the viability of cells in the presence of U0126, a MEK1/2 inhibitor. Pre-treatment of U0126 significantly restored cell viability against CK-MOX-induced cell death, which demonstrated that p-ERK may be a key regulator in the mechanism of CK-MOX-induced apoptosis of bladder cancer cells (EJ, T24, and 5637 cells). In conclusion, CK-MOX, fermented with defined composition of bacterial starters, showed antioxidant capacity, anti-inflammatory effects, and anti-cancer activity on EJ, T24, and 5637 bladder cancer cells.