들잔디에서 β-1,3-glucanase 유전자들의 클로닝 및 특성분석

Abstract

Rhizoctonia leaf blight (large patch) becomes a serious problem in Korean lawngrass, which is extremely hard to treat and develops mostly form the roots of lawngrass to wither it away. Rhizoctonia leaf blight (large patch) is caused by Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ). To develop Zoysia japonica with strong disease tolerance against this pathogenic bacterium, β-1,3-glucanase which is one of the PR-proteins known to play a critical role in plant defense reaction was cloned from Zoysia japonica. β-1,3-glucanase is known to be generated within cells when plant tissues have hypersensitive reaction due to virus or bacterium infection and secreted outside the cells to play mainly the function of resistance against pathogenic bacteria in the space between cells. This study utilized the commonly preserved part in the sequence of corn, wheat, barley, and rice which had been researched for their disease tolerance among the β-1,3-glucanase mono-cotyledonous plants. Based on the part, degenerate PCR was performed to find out the sequence and full-length cDNA was cloned. E.coli over-expression was conducted in this study to mass purify target protein and implement in vitro activation measurement and antibacterial test. Also, to interpret the functions of ZJGlu1 gene, each gene-incorporating plant transformation vectors were generated to make lawngrass transformant. Based on ZjGlu1 protein, antibacterial activity test was conducted upon 9 strains. As a result, R. cerealis, F. culmorum, R.solani AG-1(1B), and T. atroviride were found to have antibacterial activity. The gene-specific expression amount in each organ showed no huge difference in every organ based upon the transformant and against 18s gene expression amount.

잔디의 병은 곰팡이, 바이러스 등에 의해 주로 발생하고, 특히 골프장 잔디는 곰팡이에 의한 발생이 대부분이다(김 등. 2013). 한국형 잔디에서는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후에는 구제가 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2(Ⅳ)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 β-1,3-glucanase를 들잔디로부터 cloning 하였다. β-1,3-히ucanase는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포 외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 병원균에 대한 저항성기능을 하는 것으로 알려져 있다(Claude 2001). 들잔디에서 β-1,3-glucanase 유전자를 분리하기 위하여 단자엽식물 중 β-1,3-glucanase 유전자의 내병성에 대한 연구가 보고되어 있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용하여 degenerate PCR을 수행한 다음, 확보된 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 cloning 하였다. 분리한 들잔디 유래의 β-1,3-glucanase 유전자들의 기능을 분석하기 위하여 E. coli 에서 ZjGlu1을 발현·정제하여 in vitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1, ZjGlu2 유전자의 들잔디 식물 내에서의 기능을 분석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 Agrobacterium 법으로 들잔디에 형질전환을 수행하였고, 각각의 유전자가 도입된 형질전환 들잔디를 성공적으로 제작하였다. 정제 단백질을 이용한 항균활성 테스트를 위해 ZjGlu1과 ZjGlu2 단백질을 대장균 발현계에서 발현·정제를 시도하였으나, ZjGlu2 단백질은 가용성으로 발현이 되지 않아 ZjGlu1 단백질만 정제하여 항균활성 실험을 수행하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R. cerealis, F. culmorum, R. solani AG-1(1B), T. atroviride 에서 항균활성을 보였다. ZjGlu1과 ZjGlu2 유전자가 도입된 형질전환체를 이용하여 잔디의 기관별 발현량을 분석한 결과, 각 유전자는 모든기관에서 발현하였으며 기관별 발현량에 큰 차이는 없는 것으로 확인되었다. 정제한 ZjGlu1 protein을 처리한 균주의 증식 양상을 매 시간 관찰한 결과, 더 높은 농도의 ZjGlu1 protein을 처리하면 다른 균주에 대해서도 활성을 가질 가능성이 있을 것으로 판단되었다. 본 실험의 결과, 정제한 들잔디 유래의 재조합 β-1,3-glucanase 는 fungi 균주 4개에 대해서 활성을 보였으며, 이는 β-1,3-glucanase 유전자를 도입한 형질전환 들잔디가 이들 균에 대한 항균활성을 가질 수 있음을 시사한다. 현재 ZjGlu1과 ZjGlu2 유전자가 도입된 형질전환체를 각각 10개체 이상씩 확보하고 있으며, 향 후 이 형질전환 들잔디들의 항균활성을 검증할 계획이다.