저온스트레스에 유도되는 들잔디 ZjWRKY3, ZjWRKY7의 클로닝 및 기능분석

Abstract

본 연구에서는 들잔디에서 저온스트레스에 의해 유도되는 WRKY family유전자의 클로닝을 실시하기 위하여 실험을 수행하였다. WRKY family 는 식물 특이적 전사인자로서, N 말단 지역에 보존된 WRKYGQK서열 과 C 말단 지역에 zinc finger-like motif를 가진다. WRKY 단백질은 domain의 개수에 따라 두 개의 WRKY domain을 포함하는 group I, 하나의 domain을 포함하는 group II 와 III로 구분 되며, group II 와 III는 C 말단에 존재하는 zinc finger motif의 종류로 구분된다. WRKY 단백질은 스트레스 반응 유전자의 프로모터에 존재하는 cis- acting element인 W-box에 결합 하여 식물 스트레스 저항성 유전자의 전사를 조절한다고 보고되었다 (Eulgem T et al. 2000). WRKY family의 보존된 WRKY domain지역을 바탕으로 degenerate PCR을 수행하여 partial cDNA를 분리하였다. 분리된 partial cDNA sequence를 기반으로 하여 5`/3`-Rapid amplification of cDNA ends (RACE)를 수행하였다. 5`/3`-RACE sequence에 기반하여 두 개의 full-length WRKY 유전자들을 cloning하였다. full-length WRKY유전자들의 염기서열을 분석한 결과 첫 번째 단편은 ZmWRKY52와 81%의 상동성을 나타냈으며 ZmWRKY52는 아직까지 기능이 명확하게 보고되지 않았다. 두 번째 단편은 OsWRKY76과 75%의 상동성을 보였다. OsWRKY76은 벼가 냉해를 심하게 입었을 때 일어나는 도열병에 대한 저항성과 저온 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Yokotani et al., 2013). 따라서 본 연구에서 분리된 두 단편 모두 환경스트레스에 유도되는 WRKY유전자일 것으로 예상하였고, 1702 bp 길이의 첫 번째 단편은 ZjWRKY3로, 975 bp 길이의 두 번째 단편은 ZjWRKY7로 명명하였다. 여러 가지 환경스트레스 중 건조스트레스와 염스트레스는 보통 식물의 생장, 발달, 생존에 영향을 주는 스트레스이고, 일부 WRKY단백질이 식물에서 건조스트레스와 염스트레스에 반응 하는 것으로 보고되었다 (Chen et al,. 2012). 예를 들어 벼의 OsWRKY11은 HSP101 프로모터의 조절 하에 과발현 시켰을 때 노화지연 및 생존력이 향상되었다 (Wu ea al,. 2009). 따라서 분리된 ZjWRKY3, ZjWRKY7 역시 환경스트레스에 반응하는지 확인하기 위하여 여러 가지 환경스트레스 조건 하에서 발현분석을 수행하였다. 환경스트레스와의 관련성을 보기위하여 ABA, ACC, NaCl, Mannitol, 그리고 저온스트레스를 처리하고 real-time PCR을 이용하여 분석하였다. ZjWRKY3의 경우 염, 건조, 저온 스트레스에 의하여 발현이 증가한 반면, ZjWRKY7의 경우에는 동일한 조건하에서 발현이 증가하였지만 건조, 염 스트레스에서 발현양의 증감을 반복하였다. 따라서 염, 건조 스트레스 조건 하에서 ZjWRKY7의 발현은 추후 연구가 더 필요할 것으로 생각된다. 앞선 계통분석 결과에서 ZjWRKY7이 병과 관련된 OSWRKY76와 근연관계를 나타내었고, ZjWRKY7과 구조적으로 가까운 AtWRKY18, AtWRKY40, AtWRKY60은 상호작용을 통하여 환경스트레스와 생물학적 스트레스 모두에 반응하는 것으로 보고되었다 (Banerjee et al. 2015). 따라서 ZjWRKY3과 ZjWRKY7이 질병에 관련이 있을 것으로 예상하고 기내에서 성장된 zoysiagrass seedling에 Rhizoctonia solani를 처리한 후 4일간의 발현 패턴을 분석하였다. R. solani을 처리한 결과 ZjWRKY3은 처리 후 3일부터 증가하여 4일에 대조구 기준으로 발현이 약 2.5배 증가하였고, ZjWRKY7의 경우는 R. solani 처리 4일 후에 control에 비해서 약 35배 정도로 상당히 증진된 발현을 보였다. 이 결과는 ZjWRKY7이 ZjWRKY3에 비해 pathogen 침투 시 더 중요한 역할을 할지도 모른다는 것을 예상하게 하는 결과이다. 분리된 ZjWRKY7의 phelogenetic tree 분석결과 병 저항성에 연관 있음을 보였으며, 발현 분석 결과에서도 Rhizoctonia solani에 강하게 유도되어졌다. 이에 따라 이 ZjWRKY7이 병 저항성과 관련된 transcription factor로 예상을 하였다. 기존에 보고되어진 논문에서 WRKY단백질이 담배의 chitinase유전자의 프로모터 지역에 존재하는 w-box에 결합하여 하위 스트레스관련 유전자들의 발현을 조절하였다 (Yang et al. 1999). 따라서 ZjWRKY3, ZjWRKY7 또한 zoysiagrass 안에서 병 저항성 관련 유전자와 상호작용 할 것이라는 가설을 세웠고, 이것을 증명하고자 yeast one hybrid system을 이용하여 실험을 수행하였다. 실험을 수행한 결과 ZjWRKY유전자가 w-box에 결합하여 reporter gene의 전사를 활성화 시킨 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과는 ZjWRKY7이 병저항성 관련 유전자인 zoysiagrass chitinase 유전자의 발현을 조절하며, 그 과정에서 W-box가 중요한 역할을 한다는 사실을 보여주는 결과이다. 따라서 이 두 개의 유전자의 상호작용이 들잔디의 병 저항성 메커니즘에 있어 중요한 역할을 할 것으로 예상된다. 결론적으로 들잔디에서 WRKY유전자를 클로닝 하였으며, 이 유전자들이 환경스트레스 및 생물학적 스트레스에 유도되고 있음을 확인하였다. 클로닝된 ZjWRKY3과 ZjWRKY7을 들잔디에서 과발현 시켜 스트레스 저항성과 관련된 기능을 연구할 필요가 있을 것으로 사료된다.

All kinds of crops including foods, feeds and turf grasses are damaged frequently by various environmental stresses such as drought, salt, cold, and high temperature, which cause the loss of agronomic productivity. Plants cannot escape from environmental stresses. Thus, plants were evolving in the direction of overcoming environmental stresses. Some genes such as ARF, AB13, NAC, HSF, WRKY respond to environmental stresses have been reported in plants. The genes play a role in stress responses pathway of plants, the transcription factor in response to environmental stress. Typically OsWRKY76 increased the low temperature and pathogen resistance, AtWRKY28 been reported to be related to the environmental stress. Zoysiagrass (Zoysia japonica Steud.) is used primarily useful for the garden or the golf course. But WRKY, environmental stress-related gene, is unknown in zoysiagrass. In this study, ZjWRKY3, ZjWRKY7, which included one WRKY domain, were isolated in zoysiagrass. Expression of ZjWRKY3, ZjWRKY7 was increased at low temperature, drought, and salt stress. Furthermore, infection of Rhozoctonia solani, which causes brown patch, induced expression of ZjWRKY3, ZjWRKY7. ZjWRKY3, ZjWRKY7 bind to the W-box of the Zjchi promoter and it was predicted regulates transcription. Thus, ZjWRKY3, ZjWRKY7 regulate abiotic and biotic stress related downstream genes as transcription factor.