백겨자(Sinapis alba)의 종자로부터 효소 myrosinase의 분리 및 특성

Abstract

Myrosinase(thioglucosidase, EC 3.2.1.147)는 유일하게 알려진 S-glycosidase이며, glycoside hydrolase family 1(GH1)에 속한다. Myrosinases은 주로 십자화과(Brassicaceae)에서 발견되며, myrosinase와 함께 십자화과에 주로 존재하는 glucosinolates의 가수 분해를 촉진한다. 본 연구에서는 효소 myrosinase가 풍부한 십자화과 일종인 백겨자(Sinapis alba) 종자로부터 myrosinase를 분리 정제하고, 열역학적 특성과 기질 특이성 그리고 효소 반응속도에 영향을 미치는 화합물에 대하여 조사하였다. 효소 myrosinase는 백겨자 종자로부터 추출된 조효소액을 황산암모늄으로 침전 분획한 후 Concanavalin A-Sepharose column chromatography 및 gel permeation chromatography을 사용하여 순차적으로 정제하였다. Myrosinase의 정제 정도는 native polyacrylamide gel electrophoresis(native-PAGE)를 사용하여 단백질 염색 및 gel상에서 methyl red를 이용한 효소 활성 염색으로 조사하였다. Native-PAGE에서 확인된 2개의 myrosinase isozymes의 분자량은 각각 171 kDa 및 476 kDa인 것으로 추정된다. 백겨자 종자의 myrosinase는 최적반응온도 43℃이며, myrosinase의 불활성화에 필요한 활성화 에너지는 18.3 kcal/mol이었다. 효소의 기질에 대한 친화도를 나타내는 상수 Km과 최대반응속도 Vmax는 각각 allylglucosinolate (sinigrin)에 대해서는 1.03 mM 및 270.27 µmole/min, 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (4-NPG)에 대해서는 3.77 mM 및 29.67 µmole/min, 그리고 3-indoxyl β-D-glucopyranoside (indican)에 대해서는 0.12 mM 및 82.64 µmole/min이었다. 2-(hydroxymethyl)phenyl-β-D-glucopyranoside (salicin)은 myrosinase에 의해 가수분해 되지 않았다. Sinigrin과 비교할 때 salicin과 indican은 myrosianse에 대한 우수한 기질이 아니었다. Myrosinase의 보조인자로 알려진 L-ascorbic acid는 0.3 mM 농도에서 기질 sinigrin과 4-NPG의 분해를 각각 최대 4.0배, 1.6배 촉진하였으나, 0.6 mM 이상에서는 오히려 효소활성을 저해하였다. Thio 화합물인 cysteine, glutathione, 2-mercaptoethanol 및 methionine이 myrosinase 촉매 활성에 미치는 영향은 사용된 기질에 따라 다르게 나타났다.

Myrosinase(thioglucosidafse, EC 3.2.1.147) is the only known S-glycosidase, which belongs to glycoside hydrolase family 1. Myrosinases are mostly found in the Brassicaceae family, and catalyze the hydrolysis of secondary plant metabolites recognized as glucosinolates. In this study, myrosinases were isolated from the white mustard (Sinapis alba) seeds which are one of the richest in the enzyme. Its thermokinetics, substrate specificity and effector compounds were investigated. The enzyme was purified from white mustard seeds by a sequential processes of ammonium sulfate fractionation, Concanavalin A-Sepharose column chromatography, and gel permeation chromatography. The purity of the myrosinase preparation was confirmed by native polyacrylamide gel electrophoresis and on-gel activity staining with methyl red. The molecular weights of the two intact isozymes were estimated to be 171 kDa and 476 kDa, respectively. The optimum catalytic reaction temperature of the major myrosinase was 43℃ and the activation energy for its inactivation was 18.3 kcal/mol. Its Km and Vmax were 1.03 mM and 270.27 μmol/min for allylglucosinolate (sinigrin), 3.77 mM and 29.67 μmol/min for 4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (4-NPG), and 0.12 mM and 82.64 μmol/min for 3-indoxyl β-D-glucopyranoside (indican), respectively. Being compared with sinigrin, neither 2-(hydroxymethyl)phenyl-β-D-glucopyranoside (salicin) nor indican was a good substrate of the myrosinase. L-Ascorbic acid, a known cofactor of myrosinase, showed 4.0-fold and 1.6-fold activation for substrate sinigrin and 4-NPG, respectively, around 0.3 mM but inhibited myrosinase activity at higher concentration than 0.6 mM. Sulfur-containing compounds including cysteine, glutathione, 2-mercaptoethanol and methionine showed different effects on the enzyme activity depending on the substrate used, sinigrin or 4-NPG.