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들깨의 고효율 재분화 및 형질전환 체계 확립

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Alternative Title
Establishment of a highly efficient plant regeneration and transformation system in Korean perilla
Abstract
본 연구는 들깨의 유식물체에서 캘러스 유도를 통한 고효율의 재분화 및 형질전환 체계를 구축하기 위해 연구를 진행하였다. 캘러스는 잎, 자엽, 하배축 중 0.1 mg/L NAA 와 0.5 mg/L BA 가 첨가된 배지에서 배양된 다유들깨의 하배축에서 가장 건강한 캘러스가 형성되었다. 암상태와 장일조건에서 각각 캘러스를 유도한 후 신초 재분화를 유도했을 때 모든 조건에서 남천들깨보다 다유들깨가 재분화율이 월등하게 높았다. 가장 높게 나타난 0.1 mg/L NAA 와 0.5 mg/L BA 배지의 암상태와 장일조건에서 다유들깨 하배축의 신초 재분화율은 각각 86.7%와 84.4%로 두 조건 간 차이는 낮은 것으로 조사되었다. 본 연구에서 다유들깨의 하배축으로부터 고효율의 재분화 조건을 확립하기 위해 다양한 식물생장호르몬 조합실험을 수행한 결과 NAA 없이 0.5 mg/L BA 만 첨가된 배지에서 가장 높은 90%의 재분화율을 보여 주었으며 이 중 정상적인 식물체가 70.5%, 비정상적인 식물체가 19.3%로 조사되었고 NAA 가 첨가되거나 농도가 높아질수록 비정상 식물체의 출현율이 높아졌다. 정상적으로 재분화된 신초는 1/2 MS 배지로 옮긴 후 10-15 일 후에 뿌리가 관찰되었고 30 일 후에는 완전한 식물체로 성장하였다. 치상된 다유들깨 하배축은 OD600=0.5~0.6 의 Agrobacterium 균액에서 감염하였고 500 mg/L cefotaxime 과 0.5 mg/L PPT 가 함유된 Selection medium 에서 선발한 28 개의 후보 형질전환체 중 4 개가 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 본 연구에서 확립된 다유들깨 하배축을 이용한 재분화 체계는 지금까지 보고된 다른 들깨 품종들의 재분화 체계에 비해 재분화 효율이 높았으며, 이 고효율 재분화 체계를 이용하여 들깨의 형질전환 제조 체계를 확립하였다. 앞으로 들깨에서 조직배양과 형질전환에 의존하는 유전자편집 등의 분자육종 분야에 유용하게 이용하면 높은 경제적 가치를 가져오는 들깨 품종을 효율적으로 얻을 수 있을 것으로 기대된다.|This study was conducted to establish a highly efficient plant regeneration and transformation system in Perilla frutescence L. The healthiest callus was formed on the hypocotyl cultured in a medium containing 0.1 mg/L NAA and 0.5 mg/L BA, outperforming the leaf and cotyledon samples. In both dark and long-day conditions, Dayu consistently exhibited significantly higher shoot regeneration rates compared to Namcheon. The highest shoot regeneration rate in Dayu was observed at the hypocotyl under the conditions of 0.1 mg/L NAA and 0.5 mg/L BA media, with shoot regeneration rates in Dayu hypocotyl reaching 84.4% and 86.7% under dark and long-day conditions, respectively. This study tested various combinations of plant growth regulators to establish an optimal shoot regeneration condition from Dayu's hypocotyl. The results demonstrated that the highest shoot regeneration rate, at 90%, was achieved when only 0.5 mg/L of BA was added to the medium without NAA. Among the regenerated shoots, 70.5% were normal plants, while 19.3% were abnormal. The addition of NAA or an increase in its concentration led to a higher occurrence of abnormal plants. After the regenerated shoots were transferred to 1/2 MS medium, roots were observed within 10-15 days. By the 30th day, they had developed into complete plants. Hypocotyl of Dayu infected with Agrobacterium infection medium of OD600=0.5~0.6. Four out of 28 candidate plants selected from Selection medium containing 500 mg/L cefotaxime and 0.5 mg/L PPT were identified for genotyping. The results obtained from the hypocotyl of Dayu, a Korean perilla variety, has higher regeneration efficiency than other perilla varieties reported at present, and the efficient transformation system of Perilla was established by using this efficient regeneration system. The results obtained from the hypocotyl of Dayu, a Korean perilla variety, would contribute high economic value in efficient tissue culture system and transformation system.
Author(s)
서여월
Issued Date
2024
Awarded Date
2024-02
Type
Dissertation
URI
https://dcoll.jejunu.ac.kr/common/orgView/000000011862
Alternative Author(s)
Xu Ruyue
Affiliation
제주대학교 대학원
Department
대학원 생명공학부
Advisor
이효연
Table Of Contents
요약 1
Abstract 3
표 차례 5
그림 차례 6
I. 서론 10
II. 재료 및 방법 13
1. 들깨 품종 및 시료의 무균 처리 13
2. 들깨 캘러스 유도 및 재분화 13
2-1. 들깨 캘러스 및 재분화 유도 13
2-2. 뿌리 유도 및 식물 순화 14
3. 형질전환 vector 구축 및 Agrobacterium 형질전환 14
3-1. pKHG1125-OSISAP1 클로닝 14
3-2. Binary vector 제조 및 Agrobacterium tumefaciens transformation 16
4. 다유들깨 감염 및 형질전환체 선발 16
4-1. A. tumefaciens 균배양 16
4-2. A. tumefaciens 감염 및 공동배양 17
4-3. 재분화 유도 및 선발 17
5. 형질전환 다유들깨의 유전자 도입 확인 18
5-1. PAT 단백질의 발현 확인 18
5-2. Genomic DNA 추출 및 PCR 분석 18
III. 결과 및 고찰 21
1. 조직배양 21
1-1. 자엽, 하배축과 잎의 캘러스유도 21
1-2. 암/장일조건에 캘러스유도 22
1-3. 건강한 신초의 재분화 조건 확립 24
1-4. 뿌리유도 24
2.형질전환 다유들깨의 선발 및 유전자 도입 확인 24
2-1. 하배축 통해 감염된 형질전환 다유들깨의 선발 25
2-2. 형질전환 식물체의 유전자 도입 확인 26
IV. 종합 고찰 43
V. 인용문헌 45
Degree
Master
Publisher
제주대학교 대학원
Citation
서여월. (2024). 들깨의 고효율 재분화 및 형질전환 체계 확립.
Appears in Collections:
Faculty of Biotechnology > Molecular Biotechnology
Authorize & License
  • AuthorizeOpen
  • Embargo2024-02-12
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